雞傳染性支氣管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及其免疫原性

張 愉，袁 園，蘇艷靜，廖健淇，張 韜，張麗娟，范文勝，韋 平，磨美蘭

(廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

雞傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性、呼吸道傳染的病毒性疾病，呈世界范圍流行。近年來,IB流行更加嚴(yán)重，給養(yǎng)殖戶帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。IBV基因組十分容易發(fā)生突變、缺失、插入及毒株間的同源重組，導(dǎo)致新基因型甚至新血清型不斷出現(xiàn)，且各血清型間交叉保護(hù)作用強(qiáng)弱不一[2-3]。IBV變異性極大以及具有地區(qū)流行特征，使得現(xiàn)有商品疫苗基本不能提供完全有效的保護(hù)[4]，且目前常用的疫苗在安全性和免疫原性方面存在缺陷[5-6]。因此，非常有必要研發(fā)與當(dāng)?shù)豂BV優(yōu)勢(shì)血清型相吻合且高效安全的新型疫苗。

S蛋白是IBV最大的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒入侵細(xì)胞時(shí)，S蛋白被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解為S1和S2等2個(gè)亞型糖蛋白。S1蛋白主要產(chǎn)生血凝抑制抗體和誘導(dǎo)大部分病毒中和抗體[7-8]，是最重要的結(jié)構(gòu)蛋白和保護(hù)性抗原，還決定了IBV毒株的血清型[1,9]；S2蛋白在大多數(shù)毒株中高度保守，主要激活病毒與宿主細(xì)胞融合，誘導(dǎo)中和抗體的抗原決定簇具有免疫優(yōu)勢(shì)[10-11]。因S蛋白相對(duì)分子質(zhì)量太大難以表達(dá)，很少有關(guān)于全長S蛋白表達(dá)的報(bào)道。目前，國內(nèi)外對(duì)IBV S基因的表達(dá)大多數(shù)都局限于對(duì)S1基因或截短的S或S1基因的研究[9,12]，尚未見其全長S蛋白表達(dá)的報(bào)道。

廣西家禽養(yǎng)殖量很大，IB近年來嚴(yán)重威脅廣西養(yǎng)殖業(yè)[13]。本試驗(yàn)以IBV廣西地方流行毒株優(yōu)勢(shì)血清型代表株GX-YL5為對(duì)象，應(yīng)用昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其S蛋白，制備了重組S蛋白的兔多抗血清，并驗(yàn)證其反應(yīng)原性和免疫原性，以期為研究IBV S蛋白的生物學(xué)功能、基因工程亞單位疫苗以及診斷試劑等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞、病毒及試驗(yàn)動(dòng)物pFastBacTM/HBM-TOPO轉(zhuǎn)座載體和DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞購自Invitrogen公司；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司；Sf9昆蟲細(xì)胞、IBV GX-YL5毒株、對(duì)照毒株傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、馬立克病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)和禽偏肺病毒(aMPV)為廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所保存；新西蘭大白兔購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑總RNA抽提試劑盒和DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；E.Z.N.A.?Endo-free Plasmid DNA Mini Kit購自O(shè)MEGA公司；BamHⅠ和HindⅢ購自TaKaRa公司；Sf-900TMⅡ SFM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自GIBCO公司；SIM SF昆蟲培養(yǎng)基購自北京義翹神州科技有限公司；抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgY購自Abbkine公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG購自康為世紀(jì)生物公司；Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity和轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡReagent購自Invitrogen公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與目的基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank中IBV GX-YL5毒株的序列(HQ848267.1)設(shè)計(jì)S基因?qū)?yīng)的引物，上游引物P1：5′-AATTTGTTTCATTCTGGTAATTATGTG-3′；下游引物P2：5′-AGCAGACTTTTTAGGTCTGTATTG-3′。后期用于重組桿粒PCR鑒定及轉(zhuǎn)染后PCR鑒定的M13載體通用引物，上游引物P3：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′；下游引物P4：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。引物交由北京華大基因公司合成。將本課題組前期構(gòu)建的pEasy-HBM-S重組質(zhì)粒保存菌重新增殖后，進(jìn)行質(zhì)粒抽提，利用Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity擴(kuò)增S基因片段。

1.4 重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建與鑒定將獲得的S基因片段的純化產(chǎn)物與pFastBacTM/HBM-TOPO利用拓?fù)浞磻?yīng)進(jìn)行平末端連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過菌液PCR、酶切鑒定及測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。將鑒定完全正確的陽性單克隆菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFastBacTM/HBM-TOPO-S。

1.5 重組桿狀病毒的獲取與純化抽提S基因重組轉(zhuǎn)座載體保存菌的質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化MAX Efficiency?DH10BacTMCompetentE.coliCells，經(jīng)Gen、Kan、Tet 3種抗生素及IPTG、X-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單克隆并用M13引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)目的片段(2 500 bp+插入目的基因片段)和300 bp的條帶時(shí)，再重新劃板篩選，繼續(xù)挑取純白菌落，直至擴(kuò)增產(chǎn)物只出現(xiàn)目的片段(2 500 bp+插入目的基因片段)，則純化完成。抽提轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒獲得純化的重組桿粒，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞以獲得重組桿狀病毒rHBM-S。

1.6 重組蛋白的鑒定

1.6.1IFA鑒定 經(jīng)PCR鑒定完全正確的重組桿狀病毒繼續(xù)在Sf9細(xì)胞中進(jìn)行增殖培養(yǎng)至第4代，接種處于對(duì)數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞(同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照)，培養(yǎng)72 h待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，進(jìn)行IFA鑒定。以鼠抗His標(biāo)簽的單克隆抗體(1∶500稀釋)為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶300稀釋)為二抗，倒置熒光顯微鏡觀察記錄結(jié)果。

1.6.2Western blot鑒定 將P4代重組桿狀病毒接種于Sf9細(xì)胞中(同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照)，培養(yǎng)72 h，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀，進(jìn)行Western blot分析。分別以鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體和本課題組制備保存的抗GX-YL5毒株的雞多抗血清(1∶2 000稀釋)為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗雞IgY(1∶5 000稀釋)為二抗，ECL顯色觀察蛋白的表達(dá)。

1.7 重組S蛋白的純化和多抗血清的制備按照前期摸索的重組S蛋白表達(dá)的最佳條件大量表達(dá)后，采用Ni-NTA樹脂進(jìn)行重組蛋白的純化，純化步驟按說明書進(jìn)行，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。純化的重組S蛋白經(jīng)超濾管濃縮后，測(cè)定其蛋白質(zhì)量濃度，并調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度至500 mg/L，免疫健康成年新西蘭大白兔，共免疫4次，每次免疫間隔時(shí)間為10 d。首免使用1 mg重組S蛋白與弗氏完全佐劑等比例乳化混勻，加強(qiáng)免疫使用500 μg重組S蛋白與等量弗氏不完全佐劑等比例混勻，第4次免疫后10 d進(jìn)行心臟采血并分離血清。首免前采血作為陰性血清對(duì)照。

1.8 多抗血清的特性驗(yàn)證

1.8.1IFA驗(yàn)證 對(duì)數(shù)生長期Sf9昆蟲細(xì)胞感染重組桿狀病毒rHBM-S后72 h進(jìn)行IFA鑒定。一抗使用制備的兔抗S蛋白多抗血清(1∶200稀釋)，二抗使用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶300稀釋)，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。

1.8.2Western blot驗(yàn)證 對(duì)數(shù)生長期Sf9細(xì)胞感染重組桿狀病毒rHBM-S，72 h細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)收集表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。用制備的兔抗S蛋白多抗血清(1∶4 000稀釋)作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)作為二抗進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陰性血清對(duì)照。

1.8.3間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià) 用純化重組S蛋白作為包被抗原，包被質(zhì)量濃度為10 mg/L，包被后用5%脫脂奶粉封閉液于37℃濕盒中封閉2 h，采用間接ELISA方法檢測(cè)重組S蛋白兔多抗血清抗體效價(jià)。將多抗血清作為一抗，用PBST稀釋成1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600，1∶51 200共11個(gè)稀釋度；首免前的陰性血清作為陰性對(duì)照，同等稀釋度稀釋；用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)作為二抗；Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長下的D值。若兔多抗血清不同稀釋度的D值/同等稀釋度陰性血清的D值>2.1，則判定為陽性，反之，則判定為陰性。以最高抗體稀釋度為陽性的血清稀釋度的倍數(shù)作為該血清的抗體效價(jià)。

1.8.4多抗血清的特異性鑒定 采用間接ELISA方法，分別以IBDV、NDV、MDV、AIV、ALV、aMPV病毒液、陰性尿囊液和純化的重組S蛋白作為抗原，多抗血清(1∶25 600稀釋)作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)作為二抗，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長下的D值。

1.8.5中和試驗(yàn) 參照本課題組方法[14]取18～20日齡健康雞胚的氣管制備氣管環(huán)。參照Reed-Muench法計(jì)算GX-YL5株的雞胚氣管環(huán)半數(shù)感染量(TOC-ID50)和采用稀釋多抗血清固定病毒的方法進(jìn)行TOC中和試驗(yàn)[3]。設(shè)立GX-YL5毒株多抗血清陽性對(duì)照和陰性血清對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 S基因的擴(kuò)增及重組轉(zhuǎn)座載體的鑒定經(jīng)RT-PCR得到大小為3 453 bp的S基因，與目的片段預(yù)期大小相符。重組轉(zhuǎn)座載體pFastBacTM/HBM-TOPO-S的 PCR鑒定表明獲得約為3 453 bp的S基因條帶，BamHⅠ單酶切得到與預(yù)期大小相符的8 277 bp片段，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到與預(yù)期大小相符的4 670 bp和3 607 bp的2個(gè)片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果正確，表明成功構(gòu)建了S基因的重組轉(zhuǎn)座載體。

2.2 重組桿狀病毒的PCR鑒定將重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacTM/HBM-TOPO-S轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)胞，經(jīng)初步篩選后菌落PCR鑒定可見300 bp和5 953 bp 的2條片段，重新劃線純化篩選后，菌落PCR鑒定只含有5 953 bp的條帶，條帶大小均符合預(yù)期(圖2)，表明純化的重組桿粒構(gòu)建成功。

將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到的重組桿狀病毒用S基因特異性引物及M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，S基因特異性引物PCR擴(kuò)增出3 453 bp 的條帶，M13載體通用引物PCR擴(kuò)增出6 043 bp(3 453 bp+2 500 bp)的條帶，且空桿粒擴(kuò)增產(chǎn)物為300 bp，未感染細(xì)胞M13引物PCR鑒定沒有條帶(圖3)，表明獲得純化的重組桿狀病毒rHBM-S。

M.1 kb DNA Ladder；1.pFastBacTM/HBM-TOPO-S雙酶切鑒定；2.pFastBacTM/HBM-TOPO-S單酶切鑒定；3.S基因特異性引物菌液PCR鑒定

M1.1 kb DNA Ladder；M2.Trans 2kTM 2000 DNA Marker；1.純化的rHBM-S PCR產(chǎn)物；2.未純化的rHBM-S PCR產(chǎn)物；3.空桿粒PCR產(chǎn)物

2.3 重組S蛋白的IFA鑒定將鑒定正確的重組桿狀病毒接種處于對(duì)數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72 h待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，進(jìn)行IFA鑒定。IFA檢測(cè)結(jié)果顯示，感染rHBM-S的細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)了極強(qiáng)的綠色特異性熒光，空載體對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組無特異性熒光(圖4)，表明重組S蛋白已獲得表達(dá)。

A.感染rHBM-S的細(xì)胞；B.空載體對(duì)照；C.細(xì)胞對(duì)照

2.4 重組S蛋白的Western blot鑒定Western blot鑒定結(jié)果顯示，重組S蛋白可與抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體(圖5A)及抗GX-YL5毒株的多抗血清(圖5B)反應(yīng)，在感染細(xì)胞沉淀均出現(xiàn)與天然蛋白大小一致的190 kDa特異性蛋白帶。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 kDa);1.感染細(xì)胞培養(yǎng)上清;2.感染細(xì)胞沉淀;3.空載體對(duì)照;4.細(xì)胞對(duì)照。A.重組S蛋白與抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗反應(yīng)；B.重組S蛋白與抗GX-YL5毒株的多抗血清反應(yīng)

2.5 多抗血清的特性驗(yàn)證

2.5.1多抗血清的IFA鑒定 IFA檢測(cè)結(jié)果表明，制備的多抗血清能夠與表達(dá)的重組S蛋白結(jié)合，感染的細(xì)胞表面呈現(xiàn)較強(qiáng)的特異性熒光，而細(xì)胞對(duì)照未檢測(cè)到特異性熒光信號(hào)(圖6)，說明制備的抗S蛋白多抗血清具有良好的特異性。

A.感染rHBM-S的Sf9細(xì)胞；B.細(xì)胞對(duì)照

2.5.2多抗血清的Western blot鑒定 Western blot鑒定結(jié)果顯示，制備的多抗血清與感染重組桿狀病毒rHBM-S的表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)，出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的190 kDa特異性蛋白帶，而陰性血清未出現(xiàn)相應(yīng)目的條帶(圖7)，說明制備的血清特異性較好，且能夠用于Western blot驗(yàn)證。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(10～180 kDa)；1.S蛋白多抗血清；2.S蛋白陰性血清

2.5.3多抗血清抗體的間接ELISA效價(jià)測(cè)定結(jié)果 將純化后的重組S蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA檢測(cè)多抗血清的抗體效價(jià)。比較多抗血清不同稀釋度下D450值及P/N值，確定制備的S蛋白多抗血清的抗體效價(jià)為1∶25 600(表1)。

表1 S蛋白血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 D450值

2.5.4多抗血清的特異性鑒定結(jié)果 間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，該多抗血清對(duì)重組S蛋白有很強(qiáng)的特異性，與參考毒株IBDV、NDV、MDV、AIV、ALV、aMPV沒有交叉反應(yīng)(表2)。

表2 多抗血清特異性鑒定

2.5.5多抗血清的中和滴度檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)Reed-Muench法測(cè)得GX-YL5毒株TOC-ID50為10-6.46/0.2 mL。氣管環(huán)中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，S蛋白多抗血清中和滴度為1∶512，GX-YL5多抗血清陽性對(duì)照的中和滴度為1∶512，且陰性血清對(duì)照無中和作用，表明制備的兔抗S蛋白多抗血清對(duì)IBV具有明顯的中和作用，重組S蛋白具有良好的免疫原性。

3 討論

S基因是IBV最主要的抗原基因，其編碼的S蛋白是IBV最大的結(jié)構(gòu)蛋白[15]。S蛋白具有許多重要的生物學(xué)功能，包括含有與病毒中和、血凝抑制抗體、細(xì)胞吸附、組織親和性、毒力、血清型特異性有關(guān)的抗原位點(diǎn)[16-17]，也是IBV蛋白中變異程度最大的結(jié)構(gòu)蛋白[18]，因此表達(dá)S蛋白作為診斷試劑或研發(fā)基因工程亞單位疫苗都是比較理想的。

不同的外源蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量有所差異，獲得最大的蛋白表達(dá)量是研發(fā)重組亞單位疫苗和大量表達(dá)蛋白制備多克隆抗體的前提和基礎(chǔ)。因IBV S蛋白相對(duì)分子質(zhì)量太大難以表達(dá)，大多研究都是基于S1蛋白或截短的S蛋白的表達(dá)。沈行燕[19]利用原核細(xì)胞表達(dá)了IBV-ZJ971毒株的 S蛋白，但大小只有118 kDa，且表達(dá)量不高。唐應(yīng)華等[20]運(yùn)用昆蟲桿狀病毒對(duì)IBV DS10株的S基因進(jìn)行了表達(dá)，但只是在研究中利用IFA試驗(yàn)鑒定了其重組蛋白的反應(yīng)原性，未對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行考究。LIU等[21]的報(bào)道，他們應(yīng)運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了IBV H120株的S蛋白，蛋白大小為170 kDa，與IBV S蛋白的天然大小(170～200 kDa)較接近，但是表達(dá)的毒株不是地方流行株。目前，關(guān)于在原核表達(dá)系統(tǒng)中制備IBV M和E蛋白多克隆抗體的研究已有報(bào)道[22-23]，但還沒有在真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBV全長S蛋白并進(jìn)行多克隆抗體制備的相關(guān)研究。

本試驗(yàn)對(duì)GX-YL5株S蛋白的全長相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行估算，其相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)約為128 kDa，采用了具有昆蟲細(xì)胞能識(shí)別和剪切的HBM信號(hào)肽的pFastBacTM/HBM-TOPO桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)成功在真核表達(dá)系統(tǒng)中獲得了相對(duì)分子質(zhì)量約為190 kDa的全長S蛋白，與天然S蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小相符，說明表達(dá)的S蛋白在真核系統(tǒng)中得到了較為完備的修飾。經(jīng)過進(jìn)一步純化進(jìn)而免疫新西蘭大白兔，制備的多抗血清在IFA、Western blot和特異性驗(yàn)證試驗(yàn)中都呈現(xiàn)較好的特異性。此外，該多抗血清的ELISA抗體效價(jià)高達(dá)1∶25 600，中和試驗(yàn)滴度為1∶512，與GX-YL5全病毒多抗血清相同，說明S蛋白多抗血清對(duì)IBV具有明顯的中和作用。本課題組目前分別表達(dá)了IBV廣西優(yōu)勢(shì)血清型代表株GX-YL5的S蛋白、S1蛋白、M蛋白和E蛋白，下一步考慮共感染制備病毒樣顆粒疫苗，并對(duì)其免疫原性和免疫保護(hù)作用及初步臨床應(yīng)用進(jìn)行研究。

本試驗(yàn)利用昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了IBV全長S蛋白并制備了多抗血清，且具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性，為進(jìn)一步研究IBV S蛋白的生物學(xué)功能、研發(fā)診斷試劑、制備基因工程亞單位疫苗和病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎(chǔ)，也為利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行其他冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)及多抗的制備提供了借鑒和參考。