1株基因重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒的新型變異和遺傳進化分析

胡 棟,朱迎春,趙 情,龐 恒,李傳剛,王亭亭,常維山,彭 軍*,吳家強

(1.山東農業大學 動物科技學院 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室/農業部動物疫病病原生物學華東科學觀測實驗站，山東 泰安271018;2.山東省農業科學院 畜牧獸醫研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrom,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種抑制機體免疫系統及主要引起母豬流產的傳染病[1]。該病在臨床上主要導致懷孕母豬流產、早產、死胎、弱胎、木乃伊胎及病豬部分神經性癥狀[2]。PRRSV于1987年首次在美國北卡羅來納州被發現[3]，后來經分離確認PRRSV傳播至歐洲。我國于1996年首次發現并確認該病，并迅速蔓延至全國，后來又經2006年暴發“高熱病”以來，該病一直不斷發生，現已成為影響全球養豬業健康發展的重大疫病之一。PRRSV按基因的變異類型可劃分為以VR2332株為代表的經典美洲型和以Lelystad Virus株為代表的經典歐洲型和近來確認的NADC30美洲型這三大基因型。PRRSV不同毒株主要是依據基因組的變異程度大小來進行區分，其中以Nsp2和ORF5基因的變異程度最大，ORF3次之。對PRRSV經典美洲型毒株和經典歐洲型毒株的基因組進行比較，以Nsp2所編碼的氨基酸的同源性約為40%，以ORF3所編碼的氨基酸的同源性約為55% ，而以ORF5所編碼的氨基酸的同源性約為53%。因此，對比不同毒株Nsp2、ORF3及ORF5基因的變異程度基本上可以反映出PRRSV整個基因組序列的變異情況[4]。

本試驗所采集病料豬場的病豬在臨床表現出不同程度的精神沉郁、食欲減少、發熱、呼吸困難；懷孕母豬流產，部分豬舍母豬可達到60%左右的流產率，早產、死胎、木乃伊胎現象嚴重；部分新生仔豬出現呼吸困難、運動失調及偏癱等癥狀且生長速度較其他無癥狀仔豬慢；少數仔豬耳部及體表皮膚有紫色點狀出血。剖檢病豬可見心肺部有大小不一的出血點、腎臟呈點狀出血、腸系膜淋巴結出血腫大、腹股溝淋巴結高度腫大且出血壞死。

通過采集山東泰安某疑似發病豬場發病豬的肺臟、淋巴結和血液等病料，經臨床診斷及RT-PCR鑒定后，擴增Nsp2、ORF3及ORF5基因并克隆測序，利用相關分子生物學軟件進行對比并作遺傳進化分析，以了解山東地區豬場豬群感染PRRSV基因遺傳變異的情況，為PRRSV基因的變異情況、流行病學研究和疫苗的研制等方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品處理與病毒分離無菌采取山東省泰安市某豬場疑似PRRS發病豬的肺臟、肝臟、脾臟等病料組織，標記編號后于-20℃冰箱保存。取少許疑似發病豬的肺臟、脾臟、淋巴結等組織置于研磨器中，加入1 ml滅菌PBS進行研磨。將研磨充分的組織懸液反復凍融3次，4 000 r/min離心15 min，取上清液在0.22 μm的無菌濾膜中過濾除菌后，加入培養有MARC-145細胞的細胞培養瓶中，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。每隔一段時間觀察MARC-145細胞的狀態是否出現皺縮、聚集和脫落等狀態。

1.2 主要試劑MiniBest Viral RNA/DNA Extraction Kit 5.0、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000 DNA Marker、E.coliDH5α Competent Cells等均購自TaKaRa公司。

1.3 引物設計參考GenBank已收錄的PRRSV JXA1、VR2332、CH-1a等毒株核苷酸序列，通過DNAStar軟件分析對比，采用Primer 6.0設計1對可以區分經典毒株與高致病性毒株Nsp2基因的引物R1：5′-CAACACCCAGGCGACTTCA-3′，R2：5′-TGCGTAGCAGGATCACCAAG-3′,經典毒株擴增產物大小930 bp，高致病性毒株擴增產物大小840 bp；擴增ORF3全基因引物P1：5′-GTACTTTGGATCAGGTGTTTGC-3′，P2：5′-GTGACATTGGCAGTGATGGT-3′；擴增ORF5全基因引物P3：5′-ATGAGGTGGGCAACCGTTT-3′，P4：5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGGAA-3′。病毒全基因組擴增引物序列如表1。引物送生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 擴增PRRSV全基因組擴增引物序列

1.4 PRRSV全基因組cDNA片段的RT-PCR擴增以出現CPE的第2代MARC-145細胞的培養物為模板用于擴增PRRSV全基因組cDNA。以2 μL RNA作為模板進行反轉錄，反轉錄程序按照試劑盒說明書進行獲得cDNA。PCR采用50 μL體系，其中取cDNA 4 μL作為模板，2×Taq Master Mix 24 μL，每個體系分別應用9對引物(表1)的上、下游引物各1 μL，補ddH2O至50 μL。反應參數為預變性95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個循環;72℃再延伸7 min。取部分PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，其余置4℃冰箱保存。

1.5 PRRSV Nsp2、ORF3和ORF5基因的PCR擴增采用50 μL反應體系，其中取cDNA 4 μL作為模板，2×Taq Master Mix 24 μL，分別用擴增Nsp2、ORF3和ORF5基因的上、下游引物各1 μL，補ddH2O至50 μL。反應參數為預變性95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 30s，共32個循環；72℃再延伸7 min。取10 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并置4℃冰箱保存。

1.6 目的基因的克隆測序對目的片段作膠回收并連接pMD18-T載體，反應體系為pMD18-T載體1 μL、膠回收DNA 1 μL、緩沖液5 μL、ddH2O 2 μL。16℃反應30 min后將其加入100 μL的JM109感受態細胞中冰浴30 min，經42℃加熱45 s后迅速放入冰中1 min，加入890 μL的SOC培養基并放入恒溫搖床37℃振蕩培養60 min，之后將培養液均勻涂布在含有Amp的瓊脂板上培養過夜，挑取白斑接種于LB液體培養基，按照質粒小提試劑盒提取質粒并測序(上海生工)。

1.7 Nsp2、ORF3、ORF5基因的序列比對和分析先將測序結果通過NCBI的Blast進行比對分析，找出部分同源性較高的毒株及國內外錄入的代表毒株，再利用DNAStar、DNAman、MEGA等軟件對比分析。

1.8 細胞傳代后病毒Nsp2基因檢測將經過傳代出現CPE的第5代和第10代分離毒株分別提取病毒RNA，擴增Nsp2、ORF3和ORF5基因后送測序。

1.9 重組分析根據GenBank中登錄的參考序列，利用RDP4軟件對分離的SD18毒株進行基因重組分析，篩選出親本毒株和提供重組片段的病毒株。根據RDP4軟件分析結果，利用SimPlot對SD18毒株進行全基因序列重組分析。

1.10 GP5蛋白信號肽預測利用在線軟件SignalP4.1中的神經網絡法對SD18毒株的GP5蛋白進行信號肽預測。

2 結果

2.1 病毒的分離陽性病料組織上清接種初代MARC-145細胞即出現CPE，病變細胞呈現圓縮、聚堆、拉網等狀態，而對照細胞無明顯變化(圖1)，然后對分離毒株繼續傳代培養。

A.正常MARC-145細胞；B.病變MARC-145細胞

2.2 PRRSV分離株Nsp2基因擴增結果經RT-PCR擴增鑒定，得到840 bp大小的條帶，符合高致病性PRRSV條帶大小(圖2)。

2.3 Nsp2、ORF3、ORF5基因的PCR擴增經RT-PCR分別擴增Nsp2、ORF3、ORF5基因片段后，得到約1 066，872，737 bp的特異性條帶，與預期條帶大小相符(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.陽性對照；2.SD18毒株樣品；3.陰性對照

2.4 SD18毒株全基因組序列遺傳進化樹將SD18毒株全基因組序列與國內外參考毒株進行比較并繪制遺傳進化樹,結果顯示PRRSV可分為美洲型毒株與歐洲型毒株2大類，且美洲型毒株又具有多個不同的亞種；SD18毒株為高致病性美洲毒株中的一個亞群，與早期國內分離株CH-1a等經典毒株相距甚遠，PRRSV仍在不斷變異。該分離毒株已明顯區別于以JXA1、HUN4、TJ等為代表的高致病性中國分離株，形成一個新的獨立分支，這些變異提示該分離毒株很可能在病毒的編碼蛋白及其免疫原性等方面出現了較大變化(圖4)。

2.5 SD18毒株部分氨基酸序列分析

2.5.1Nsp2基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析 運用DNAStar軟件對SD18毒株Nsp2基因核苷酸及編碼氨基酸序列進行同源性分析表明，SD18毒株的Nsp2基因核苷酸序列與近幾年國內常見高致病性毒株的同源性可達87.0%～91.2%(85.3%～90.2%)，與經典美洲毒株VR2332同源性為72.0%(67.4%)，與國內的HPBEDV毒株同源性為88.0%(81.2%)，與美國變異毒株NADC30同源性為74.7%(69.7%)，而與經典歐洲毒株Lelystad Virus同源性為50.5%(30.2%)。SD18毒株的Nsp2基因編碼氨基酸序列分別在對應VR2332毒株的830位和864位分別出現2個氨基酸的缺失，920～948位出現了29個氨基酸的連續缺失，其中第830位氨基酸位點是最新發現的缺失氨基酸。同時，Nsp2在690～894位也出現了多個氨基酸位點的變異(圖5，表2)。

M.DL2000 DNA Marker；A1.SD18 Nsp2基因擴增條帶； B1.SD18 ORF3基因擴增條帶；C1.SD18 ORF5基因擴增條帶；A2,B2,C2.陰性對照

●表示本研究的分離毒株;▲表示重組毒株

圖5 SD18毒株與PRRSV參考株Nsp2基因編碼氨基酸序列比對結果

表2 SD18毒株Nsp2基因編碼氨基酸突變位點

2.5.2ORF3基因核苷酸與編碼氨基酸序列分析 與國內外的參考毒株進行對比分析發現，SD18毒株ORF3全基因與近幾年國內高致病性毒株同源性可達87.6%～95.7%，與代表性高致病毒株CH-1a同源性為92.3%，與美國新型變異株NADC30同源性為82.5%，與歐洲經典株Lelystad Virus同源性為64.8%。而在其編碼氨基酸方面，SD18毒株的ORF3在13，71，151，225，260等位點出現了與參考毒株相比不同程度的變異，在245，246和250～259位點出現了與其他高致病性毒株相同的缺失位點，主要變異情況見表3。

表3 SD18毒株ORF3基因編碼氨基酸突變位點

2.5.3ORF5基因核苷酸與編碼氨基酸序列分析 ORF5編碼氨基酸序列變異性分析顯示在18，30，40，44，63，100，107位點出現與其他毒株不同程度的變異(表4)。

表4 SD18毒株OR5基因編碼氨基酸突變位點

2.6 ORF5基因編碼產物抗原性分析與參考株ORF5基因抗原對比分析發現，SD18毒株ORF5編碼產物抗原表位主要集中在6～16，30～39，50～60，128～132，136～141，146～155，161～183 aa與WUH1毒株具有相似的抗原性特征，但與VR2332毒株差異性較大，主要差異在30～39 aa區域，相較于VR2332毒株,SD18毒株抗原區域明顯變窄，而在6～16，50～60，136～141 aa等區域，SD18毒株抗原性卻明顯高于VR2332毒株(圖6)。

圖6 PRRSV SD18毒株ORF5基因編碼產物抗原性預測分析

2.7 分離株傳代后Nsp2基因檢測擴增出現CPE的第5代和第10代細胞SD18毒株的Nsp2、ORF3和ORF5基因并測序，結果顯示其基因序列并未發生改變，條帶大小也未見變化(圖7，8)。

M.DL2000 DNA Marker；A1.SD18 Nsp2基因擴增條帶；B1.SD18 ORF3基因擴增條帶；C1.SD18 ORF5基因擴增條帶；A2,B2,C2.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker；1.SD18 Nsp2基因擴增條帶；B1.SD18 ORF3基因擴增條帶；C1.SD18 ORF5基因擴增條帶；A2,B2,C2.陰性對照

2.8 基因重組分析利用RDP4和SimPlot對SD18分離株和參考株的全基因組序列進行重組分析,結果顯示SD18毒株在多個位置發生基因重組現象(表5,圖9)。SD18毒株的重組親本毒株為VR2332株，提供重組片段的病毒株為JXA1-R及NADC30-like毒株。

表5 以VR2332為親本的SD18分離株的重組信息分析結果

圖9 PRRSV SD18毒株的基因重組分析

2.10 GP5蛋白信號肽預測利用軟件SignalP4.1在線分析功能，采用神經網絡法預測SD18毒株GP5蛋白的信號肽，該預測方法主要有3個參數，即S、C和Y值對應每個氨基酸。預測結果中一條起伏較大的曲線表示S值的變化趨勢，在信號肽區域內S值較高。C值為剪切位點值，在剪切位點處該值最高。Y值為綜合考慮S值和C值之后的參數，要比單獨考慮C值更精確。SD18毒株GP5蛋白的信號肽預測結果如圖10所示，1～15 aa區域的S值較高且在12 aa處達到最高0.971，在32 aa處C值和Y值分別達到最高0.571和0.643，由此可知，SD18毒株GP5蛋白存在信號肽，其信號肽區域為1～31 aa，其剪切位點為31～32 aa。

圖10 SD18毒株 GP5蛋白信號肽預測結果

3 討論

PRRSV自20世紀末傳入我國以來，給我國養豬行業造成了巨大的經濟損失，尤其是2006年出現的高致病性變異毒株更對該病的防控帶來了嚴峻的挑戰[5]。該病威脅巨大的原因之一是病毒基因變異迅速，可以通過不斷的缺失、突變、重組從而極大地增加了病毒致病力的變異幾率[6]，導致原有疫苗對豬體產生的免疫保護力不足。研究調查發現，我國目前流行的PRRSV仍是以高致病性美洲毒株為主[7-8]。隨著近幾年生豬貿易進一步的擴大以及各種弱毒疫苗的不合理使用，使得PRRSV毒株的遺傳變異更加趨于復雜化和廣泛化，其中Nsp2、ORF3和ORF5基因在影響PRRSV毒株的變異規律、對宿主感染前后的致病力和病原本身的免疫原性方面有重要的作用，具有較大的研究價值。因此，加強對PRRSV基因遺傳變化規律的監測及分析，特別是對動物機體和相關免疫程序的影響，對防控PRRSV具有非常重要的理論和現實意義。

Nsp2作為PRRSV整個基因組中變異性最大的基因之一，其堿基序列的缺失、突變導致的某些氨基酸位點的變異可以作為監視PRRSV基因組遺傳變化的一個重要標志[9]。Nsp2基因的變化不僅表現在某些堿基位點的突變與缺失，更有不同長度的連續性缺失，如我國最早發現的Nsp2基因存在12個連續缺失的HB-2株[10]。另外由于2006年我國各地大規模的暴發PRRS，一種Nsp2基因出現了90個不連續堿基位點缺失的PRRSV被作為新型美洲高致病性PRRSV進入了人們的視線[11]。根據不同的報道發現，新型變異的PRRSV毒株Nsp2基因編碼氨基酸缺失位點數量正在呈不斷增加的趨勢[12]。由此可見，PRRSV的Nsp2基因變異程度高、缺失數目大，以及不同類型毒株之間的遺傳特性和抗原性的差異，使得新型突變病毒與原流行毒株之間的免疫交叉保護力較低，這或許是PRRSV難以有效防控的重要原因之一。相關研究顯示[13]，PRRSV Nsp2基因上存在與毒株致病力相關的氨基酸位點，即668位與952位氨基酸。本研究的SD18毒株Nsp2基因第668位氨基酸為R，與國內分離的早期高致病性毒株JXA1、HUN4相同。同時SD18毒株在628，703，725，752等多個位點的突變均與高致病性毒株JXA1、HUB1相同，表明SD18毒株同樣為一株具有高致病性的強毒株。而在某些Nsp2基因氨基酸位點上，SD18毒株又與JXA1、HUB1表現出不同的變化，如在749(A→V)、780(M→V)、783(H→L)、844(V→A)等出現了突變，表明SD18毒株呈現向新型毒株變異的趨勢。

ORF3同樣為PRRSV變異性最大的基因之一，其遺傳變異也在一定程度上反映了PRRSV整個毒株的變異程度和流行趨勢[14]。有研究表明，由ORF3基因編碼的GP3蛋白具有較好的免疫原性，能夠刺激機體免疫系統產生一定水平的抗體，但與GP5的抗體水平相比較低[15]，這或許是由于GP3蛋白的抗原性主要誘導機體的細胞免疫有關。相關研究證明，病毒蛋白中含有大量的糖基化蛋白，它們在識別宿主特定的靶細胞、誘導機體產生免疫應答反應與免疫逃避等方面具有重要作用[16-17]。GP3蛋白上存在許多與GP5蛋白具有相似功能的糖基化位點，而這些位點均在整個病毒的免疫逃避中發揮著重要的作用。GP3蛋白上的糖基化位點主要有N30、N43、N51、N132、N153、N161和N196，而SD18毒株GP3蛋白的這7個糖基化位點均未發生氨基酸的變異，但在別的位點卻發生了多個氨基酸的變異。與國內的高致病性代表毒株JXA1和HUB1比較，在20(F→L)、69(P→S)、71(K→N)、96(P→S)、147(V→D)、153(A→T)等氨基酸位點出現了變異，而無論與美洲經典株或高致病性株相比，SD18毒株第17位氨基酸插入了1個氨基酸S。相關試驗表明[18]，GP3蛋白在PRRSV感染受體細胞與病毒粒子裝配等方面發揮重要作用，而SD18毒株的ORF3基因這些氨基酸位點變異，是否會影響PRRSV的病原性與致病性還有待進一步研究。

據報道，PRRSV疫苗株的GP5蛋白第137位為丙氨酸，而野毒株在該位點則是絲氨酸[19]。另外，可以通過GP5的13和151位的氨基酸變異情況來判斷毒株毒力的強弱[20]。通過對本試驗SD18毒株ORF5所編碼的氨基酸分析表明，其137位為絲氨酸，符合強毒株特性之一，排除SD18毒株為疫苗株。對比SD18毒株與JXA1株等強毒株發現，在第13位與第151位氨基酸均為精氨酸，表明該試驗分離的SD18毒株為野毒株。各項研究說明，GP5蛋白在病毒入侵機體時表現出較強的抗原性[21]，表明其在破壞機體細胞免疫的過程中發揮重要作用。此外，大部分PRRSV的中和位點均位于GP5蛋白上[22]，包括27～30，37～45，180～197 aa，而37～45 aa被認為是發揮主要作用的位點。在上述位點中，起到識別中和抗體的位點分別為38,42,43,44 aa，而發揮結合中和抗體的位點則有39,40,41 aa[23]，以及剩余的2個誘騙位點，即當機體感染PRRSV時，這2個誘騙位點會首先刺激機體的免疫系統產生大量針對其表位的非中和抗體，從而延緩了免疫系統針對主要抗原表位產生的中和抗體，使得有效的特異性抗體和病毒之間存在一定的時空差異。而與VR2332等經典美洲高致病性毒株相比，SD18毒株的許多結合位點均發生了突變，首先第39位結合位點的氨基酸(L→I)突變，其次第185位(V→A)也發生了突變，這2個中和位點的突變或許會影響PRRSV刺激機體生成中和抗體的敏感性，使得機體對病毒粒子的免疫清除能力受到影響，這也許是該分離株引起本次疾病暴發的原因之一。此外，GP5蛋白作為存在多個糖基化位點的囊膜蛋白， 分別包括第30，33，34，35，44，51位氨基酸位點，而糖基化則會阻礙附近的中和抗原表位和中和抗體進行結合。本試驗分離的SD18分離株與經典高致病性毒株VR2332相比則分別在34(D→N)、35(S→N)2個氨基酸位點發生了突變，且突變的氨基酸種類一致，該糖基化位點的變化是否會影響病毒粒子中和表位的暴露以及其免疫逃避機制與致病力等都有待于進一步的調查研究。抗原性指數(antigenic index,AI)是將蛋白質片段的氨基酸序列、結構、構想與活動性等多方面因素綜合考慮而建立的一種大致預測蛋白質不同區域抗原性的分析方法，AI值的高低在一定程度上反映了相關蛋白抗原性的高低，并與組成其抗原表位的可能性大小直接相關[24]。通過分析SD18毒株ORF5的抗原性表明，其部分抗原表位與HPBED具有較為相似的特征，而與VR2332有較大的差異，主要差異表現為SD18毒株在30～39 aa抗原區域變窄，而在50～60 aa及136～141 aa等區域則明顯高于VR2332株，這些AI的改變能否干擾毒株的致病力或影響不同PRRSV疫苗的免疫保護能力等都有待進一步試驗研究。基因重組一直是人們關注的焦點之一，揭示PRRSV的基因重組對了解PRRSV的流行性有較大的必要性。參照已有的方法，本研究利用RDP4和SimPlot對SD18毒株進行重組分析，發現該株病毒在多個基因位點存在基因重組現象。SD18毒株以VR2332為親本，以疫苗株JXA1-R和國內最新出現的NADC30-like毒株提供重組片段進行基因重組，而重組的部位和數量不盡相同，重組大多發生在非結構蛋白和次要結構蛋白的區域。該PRRSV分離株由疫苗毒株提供的重組片段，提示弱毒疫苗株基因片段參與了病毒流行株的基因重組，這種現象應該進一步引起業界警惕而制定更合理的免疫計劃，避免PRRSV的進一步變異。

綜上所述，本研究分離的SD18毒株與經典毒株和高致病性毒株相比，其在Nsp2、ORF3和ORF5基因均出現了多處新的變異或缺失，包括Nsp2基因出現了不同于早期國內分離的高致病性毒株新的缺失部位、GP3蛋白的多處糖基化位點發生了改變，而GP5表面抗體中和位點同樣也出現了多個突變，表明該病毒蛋白的免疫原性可能發生了改變，從而可能影響了病毒的致病性，引起疫苗免疫接種保護效果降低，這或許是該分離株引起本次PRRSV流行的最主要原因。本研究通過對SD18病毒的Nsp2、ORF3以及ORF5基因的遺傳變異分析，豐富了PRRSV的基因信息數據庫，同時也為PRRSV的突變趨勢、致病機理及對研制新型疫苗提供了科學參考資料。