高產植酸酶乳酸菌及其黑豆酸面團發酵低植酸營養面包研究

曹偉超 羅 昆 程 新 陳 誠 鄭建仙 黃衛寧 李 寧 FILIP Arnaut 周黎源

(1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510641；3. 廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；4. 焙樂道食品集團，比利時 布魯塞爾 1201；5. 山東稻香村食品工業有限公司，山東 菏澤 274000)

烘焙食品已成為世界主流食品[1]，其中面包是消費率最高的品類之一。然而，隨著人們消費觀念的不斷提高，營養單一的小麥面包已無法滿足人們的需求。近年來，黑豆因其合理的氨基酸組成模式及高蛋白優勢而備受青睞[2]。但是，黑豆中含有多種抗營養因子，其中植酸的干物質含量可達(18.32±1.18) mg/g[3]，這些物質能與蛋白質、礦物質等多種營養成分結合，使得營養成分在人體消化過程中難以被吸收[4]。

現代烘焙行業中，酸面團常被作為一種天然的新型生物改良劑以賦予產品更高的感官品質及營養價值[5]。其中，探索微生物源的優化方法以便從自然界中獲得具有特定功能作用的目標菌株是酸面團技術研究的前沿領域之一。Teixeira等[6]發現，具有α-半乳糖苷酶活力的短乳桿菌能有效降解多種意大利豆中的棉子糖；Coda等[7]應用植物乳桿菌發酵蠶豆基質以降低縮合單寧含量；Gualberto等[8-10]研究了通過添加微生物來源的植酸酶以達到降解植酸的目的，但是將定向篩選的高植酸酶活性乳酸菌直接應用于豆類酸面團體系的研究仍未見報道。

試驗擬從豆類基質中篩選出具有高植酸酶活性的乳酸菌，并將其作為發酵劑制作黑豆酸面團面包；通過響應面設計確定黑豆酸面團的最佳發酵條件，探究發酵處理對黑豆蛋白及抗營養因子的影響，同時對黑豆酸面團面包的感官品質進行評估，旨在通過菌株篩選定向解決黑豆中的抗營養問題，為開發高蛋白、低植酸含量的營養面包及豆類酸面團技術的工業化應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

黑豆粉：山東呆豆家健康食坊；

高級面包粉：中糧鵬泰面業有限公司；

即發活性干酵母：樂斯福(明光)有限公司；

MRS肉湯培養基：杭州百思生物技術有限公司；

乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)L-19：高產植酸酶，篩選自自然發酵黑豆粉；

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)K-12：不產植酸酶，篩選自自然發酵黑豆粉；

攪拌機：5K5SS型，美國Kitchen Aid公司；

醒發箱：SPC-40SP型，新麥機械(無錫)有限公司；

切片機：SM-302型，新麥機械(無錫)有限公司；

烤箱：SM-503型，新麥機械(無錫)有限公司；

實驗室pH計：FE20型，梅特勒儀器(上海)有限公司；

恒溫恒濕培養箱：SPX-150C型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；

紫外分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

質構儀：CT3型，美國Brookfield公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 產植酸酶乳酸菌的初篩 從自然發酵豆粉(黑豆、紅豆、蠶豆、鷹嘴豆)和傳統酸面團中分離純化出245株乳酸菌，取分離純化后的乳酸菌懸浮液點接在改進后的植酸酶篩選培養基[11](含1%植酸鈣)上，30 ℃培養48 h，觀察并測量菌落及其周圍透明水解圈大小，挑選出透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株接種于瓊脂斜面培養基中，保存備用。

1.2.2 產植酸酶乳酸菌的復篩 參照GB/T 18634—2009并修改。將菌株接種至MRS肉湯中培養24 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定胞外酶活[12]。同時用無菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌菌泥兩次，然后懸浮于5 mL緩沖液中，450 W超聲處理20 min(間隔5 s)，取破碎液用于測定胞內酶活。另取5 mL活化后的乳酸菌培養24 h，離心、洗滌后烘干至恒重并記錄菌體重量[13]。取1.8 mL乙酸緩沖液(pH 5.5)于10 mL試管中，加入0.2 mL待測液(磷標準液，上清液，破碎液)后混勻，37 ℃水浴5 min，加入4 mL 5.0 mmol/L植酸鈉溶液(pH 5.5)繼續水浴30 min，最后加入4 mL終止液及顯色液，搖勻，測定415 nm處吸光度。對照組先加入終止液及顯色液再加入植酸鈉溶液。以無機磷標準液的濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 產植酸酶乳酸菌菌落形態及菌株鑒定 將貯藏于冰箱中的菌株活化兩代并劃線分離至MRS固體平板，37 ℃ 培養48 h，觀察菌落形態。進一步挑取單菌落涂布于載玻片上，革蘭氏染色后通過光學顯微鏡進行鏡檢。以DNA原液為模板進行PCR擴增，引物為27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')與1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，擴增片段通過瓊脂糖凝膠電泳檢測純度及濃度后進行測序，并進行同源性分析。

1.2.4 黑豆酸面團發酵的單因素試驗

(1) 菌懸液制備：將乳酸菌L-19在MRS液體培養基中活化至對數后期，6 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌兩次并收集菌泥，將其制成濃度為107CFU/g 的菌懸液。

(2) 面團得率(DY)對植酸含量的影響：按每100 g酸面團計，接種9%菌懸液后調節初始pH至4.5，DY值分別為150，200，250，300，350，37 ℃培養24 h，考察DY值對酸面團中植酸含量的影響。

(3) 接種量對植酸含量的影響：按每100 g酸面團計，調節初始pH至4.5，DY值為250，分別接種3%，6%，9%，12%，15%菌懸液，37 ℃培養24 h，考察接種量對酸面團中植酸含量的影響。

(4) 發酵溫度對植酸含量的影響：按每100 g酸面團計，接種9%菌懸液后調節初始pH至4.5，DY值為250，分別于23，30，37，44，51 ℃培養24 h，考察發酵溫度對酸面團中植酸含量的影響。

(5) 初始pH值對植酸含量的影響：按每100 g酸面團計，DY值為250，接種9%菌懸液后分別調節初始pH至3，4，5，6，7，37 ℃培養24 h，考察初始pH對酸面團中植酸含量的影響。

1.2.5 Box-Behnken響應面試驗 根據單因素試驗結果，依據Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behenken試驗設計原理，選取DY值、接種量、發酵溫度作為自變量，以植酸含量為響應值進行三因素三水平的響應面分析試驗，優化黑豆酸面團發酵工藝參數。

1.2.6 酸面團的制備 將高產植酸酶的乳酸片球菌L-19接至MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h，6 000 r/min離心5 min，用無菌生理鹽水洗滌兩次得菌體。將獲得的菌體懸浮于無菌水中并與黑豆粉混勻(根據最優條件，乳酸菌的初始接種量為8%、面團DY值為300)，37 ℃培養30 h，得酸面團。以不產植酸酶的乳酸菌K-12作為對照組。

1.2.7 酸面團發酵過程中pH、可滴定酸(TTA)及生長曲線的測定 取10 g黑豆酸面團樣品與90 mL無菌水攪拌20 min，靜置10 min，測其pH，采用0.1 mol/L NaOH滴定至pH 8.6，消耗的NaOH體積即為TTA[14]。稱取10 g黑豆酸面團于90 mL無菌生理鹽水中，梯度稀釋后取100 μL混合液涂布于MRS固體培養基上，37 ℃培養36 h，觀察并進行菌落計數[15]。

1.2.8 酸面團中抗營養因子含量的測定

(1) 植酸含量：參照Buddrick等[16-17]的方法并修改。稱取0.5 g樣品于50 mL離心管中，加入30 mL 0.5 mol/L 的HCl溶液，150 r/min震蕩提取3 h，5 000 r/min 離心30 min，取1 mL上清液(空白組以1 mL HCl溶液代替)與2 mL NH4Fe(SO4)2溶液(0.02%)混勻，沸水浴30 min，迅速冰浴冷卻，6 000 r/min離心30 min,取2 mL 上清液與3 mL 1%雙吡啶混勻進行顏色反應，測定519 nm處吸光度。此外，將植酸標準樣品溶解于HCl中，分別配制濃度為0.00，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mg/L的植酸溶液，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

(2) 棉子糖含量：稱取10 g酸面團樣品，預先使用石油醚回流除去脂肪，按料液比(m酸面團∶V乙醇)1∶10 (g/mL) 加入80%乙醇并于80 ℃回流1 h，抽濾，收集濾液，濾渣中加入100 mL水并攪拌1 h后重新抽濾，再次收集濾液。使用10%醋酸鉛沉淀蛋白并離心(11 000 r/min，20 min)，重復多次使蛋白質除盡，用草酸去除鉛元素。濾液經真空濃縮至100 mL，采用HPLC進行分析。色譜條件為[18]：色譜柱為Bridge BEH Amide(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以V乙腈∶V水為70∶30的混合液作為流動相；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；示差折光檢測器；檢測池溫度35 ℃。

(3) 單寧含量：準確稱取1.0 g樣品與10 mL試劑I(V鹽酸∶V甲醇為1∶100)震蕩2.5 h，4 000 r/min離心20 min，保留上清液。采用香草醛法[7]測定樣品中縮合單寧含量。以兒茶素作為標樣繪制標準曲線，測定結果以兒茶素當量表示。

1.2.9 酸面團中多肽分子量分布 稱取1.0 g樣品于燒杯中并加入50 mL流動相，120 r/min震蕩30 min，10 000 r/min 離心20 min，取上清液并過膜處理，進行HPLC分析。色譜條件[19]：色譜柱為體積排阻色譜柱TSKge12000SWXL(300 mm×7.8 mm)；以V乙腈∶V水∶V三氟乙酸為45.0∶55.0∶0.1的混合液作為流動相；紫外檢測波長220 nm；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃。

1.2.10 面包感官評定 參照楊文丹等[20]的方法制作面包，黑豆粉在面粉中的替代比例為15%。采用9分嗜好法進行感官評定，由20位經過培訓的人員(10女10男)對面包外觀、內部結構、柔軟度、口感以及整體可接受度進行評分。

1.3 數據處理

采用Excel 2013和Origin 8.5軟件進行數據處理及圖表繪制，通過SPSS 16.0軟件進行顯著性和方差分析(ANOVA)，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 產植酸酶乳酸菌的鏡檢形態及菌株鑒定

從自然發酵的豆粉(黑豆、紅豆、蠶豆、鷹嘴豆)以及傳統酸面團中分離純化出245株乳酸菌，經初篩后得到具有植酸鈣水解能力的乳酸菌共7株(見圖1)，相應的透明圈與菌落直徑比見表1。通過測定植酸酶活性進一步復篩(表2)，僅3株乳酸菌K-22、L-4、L-19表現出較高的植酸酶活性，其中L-19菌株的植酸酶活性最高，其胞外酶與胞內酶活性分別為1.36，0.30 U/mL，與Karaman等[4]的數百株乳酸菌及酵母菌相比，該菌株的植酸酶活性更高，表明L-19具備高產植酸酶特點。胞外植酸酶可與面團中的植酸直接接觸，更利于植酸的降解[21]。

圖1 L-19 植酸鈣水解圈

表1 乳酸菌的透明圈與菌落直徑比?

表2 乳酸菌的植酸酶酶活比較?

鑒于L-19的植酸酶活力最高，因此將其作為目標菌株進行后續試驗。L-19在MRS固體平板上呈乳白色扁平圓形，其邊緣整齊、表面平滑且帶有光感(見圖2)，具有典型的乳酸菌菌落特征。此外，同源性比對結果(圖3)表明該菌株L-19為乳酸片球菌，登錄號為KJ580428.1。

圖2 L-19菌落形態及鏡檢

2.2 單因素試驗

由圖4可知，提高面團的DY值能夠顯著降低植酸含量。這是因為較高的水分有利于菌株的生長代謝與相應酶的合成[22]。酸面團中的植酸含量隨接種量及發酵溫度的提高先減少后增加，當接種量為9%，發酵溫度為37～44 ℃時，更有利于植酸的降解。這可能是由于低接種量無法使目標菌株成為優勢菌群，而過高的接種量會導致體系過度酸化，抑制植酸酶的活性[23]。此外，發酵溫度也是影響乳酸菌生長代謝及酶活的重要因素，但試驗得出的最適溫度與Humer等[24]的研究結果有所差異。初始pH值對植酸降解水平沒有顯著影響。

2.3 響應面分析

2.3.1 擬合模型的建立及顯著性檢驗 在單因素試驗基礎上，選用響應面法對黑豆酸面團發酵工藝條件進行優化。利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behenken試驗設計，以DY值、接種量、發酵溫度為響應變量，以植酸含量為響應值進行數據擬合。響應面試驗因素水平編碼表見表3，Box-Behnken試驗設計及結果見表4。

對表4進行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：

Y=3.47+0.17A+0.049B+0.31C+0.22AB+0.44AC+0.12BC+0.78A2+0.36B2+0.46C2。

(1)

圖3 高產植酸酶乳酸菌系統發育樹

圖4 各因素對黑豆酸面團植酸含量的影響

表3 因素水平編碼表

表4 Box-Behnken試驗設計及結果

表5 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗?

2.3.2 響應面分析 由圖5可知，面團得率(DY)與接種量的響應面傾斜度最大，表明兩者對植酸含量的影響更加顯著。而發酵溫度與面團得率(DY)對應的等高線更偏向于呈橢圓形，說明兩者間的交互作用最為強烈。相反，接種量與發酵溫度間的交互效應最弱，其對植酸含量的影響程度也最小。

圖5 各因素交互作用對植酸含量的影響

2.3.3 實驗驗證 由Design-Expert 8.0.6軟件得出黑豆酸面團的最佳發酵條件為DY值299.17、發酵溫度36.93 ℃、接種量8.04%，此時植酸含量為3.415 mg/g。考慮到實際操作的可行性，將最佳發酵工藝調整為：DY值300、發酵溫度37 ℃、接種量8%。在此條件下進行3次驗證實驗，所得黑豆酸面團中植酸含量為3.424 mg/g與理論值相近，說明采用響應面設計得到的工藝參數真實可信，具有指導意義。

2.4 黑豆酸面團發酵過程中的菌株生長曲線比較

由圖6可知，兩株乳酸菌的初始菌落總數均為7.1 lg(CFU/g) 左右，相比于無停滯期的K-12，L-19經過短暫停滯期后進入對數增長期，說明K-12對黑豆基質的適應能力較強。而進入穩定期后，L-19的菌落總數[8.7 lg(CFU/g)]略高于K-12的[8.5 lg(CFU/g)]，說明L-19在發酵后期更加適應黑豆酸面團體系。Hammes等[25]認為發酵過程中酸面團體系內的微生物群體將趨于相對穩定狀態，其中乳酸菌的菌落總數約為8～9 lg(CFU/g)，與試驗結果一致。

圖6 黑豆酸面團發酵過程中菌株生長曲線

2.5 黑豆酸面團發酵過程中pH和TTA的變化

由圖7可知，乳酸片球菌L-19的產酸能力稍強于K-12，且兩者的酸化趨勢無明顯差異。發酵初期，黑豆酸面團體系的酸化速度較為緩慢，直至第5 h后pH出現躍變并最終穩定在4.1左右。pH的降低是乳酸菌在生長過程中合成多種有機酸的作用結果[26]，與試驗中的酸化曲線大體相符。此外，酸化現象被視為酸面團發酵過程中最重要的技術特征之一，適宜的酸化有利于改善面包品質。Buddrick等[16]認為酸面團體系的最適pH為3.5～4.3，與試驗中面團的酸化程度相近，表明兩株乳酸菌具備可應用性。

2.6 黑豆酸面團發酵前后的抗營養因子含量

由表6可知，乳酸菌發酵能夠有效降解體系中的抗營養因子，相比于發酵前的植酸含量，采用L-19、K-12發酵的黑豆酸面團其植酸含量分別降低了62.70%，37.84%，說明L-19對植酸的降解作用更強，該降解率也優于Karaman等[4，27-28]的研究結果，這進一步表明L-19具備高產植酸酶的特性。棉子糖、縮合單寧含量經L-19發酵后分別降低了35.29%，25.61%，但與植酸降解率相比仍有較大差距，說明乳酸片球菌L-19具有特定降解植酸的功能作用。抗營養因子的降解主要源于酸性環境下激活的植酸酶及菌株生長代謝過程中合成的微生物酶[29]。

圖7 黑豆酸面團發酵過程中pH和TTA的變化

表6 黑豆酸面團發酵前后的抗營養因子含量?

2.7 黑豆酸面團中的多肽分子量分布

研究酸面團發酵過程中黑豆蛋白經酶解釋放的具有生物學功能多肽[30]分子量變化具有重要意義。由表7可知，黑豆酸面團中的多肽分為8種不同的分子量水平，其中分子量處于50～2 000 Da的小分子活性肽在兩種酸面團中分別占51.47%，45.07%，這是因為乳酸片球菌L-19產生的植酸酶降低了黑豆基質中的植酸含量，從而避免了體系中的其他蛋白酶系與其發生非特異性結合而失活[31]，使黑豆蛋白水解程度得到了提升，因此乳酸片球菌L-19有助于改善黑豆酸面團面包的營養特性。

2.8 面包產品的感官評定

由圖8可知，兩種酸面團面包的整體可接受度較高，L-19黑豆酸面團面包的品質(7.8)優于對照組K-12(7.4)，而未經發酵的黑豆面包最不易被接受。研究[32]表明，酸面團技術對外加豆類蛋白面包的品質具有改善作用，與試驗結果相似。其中植酸含量的降低是改善面包品質的重要因素之一，是由于植酸干擾面團面筋網絡的形成[33]，從而影響面包品質。

表7 發酵后黑豆酸面團中的多肽分子量分布

圖8 面包感官評定

3 結論

研究表明，試驗篩選的乳酸片球菌L-19具有高產植酸酶的功能特性，利用該菌株作為發酵劑制作的黑豆酸面團有利于改善面包的營養及感官品質。黑豆基質中，乳酸片球菌L-19生長良好、酸化程度適當。經發酵后，黑豆中的多種抗營養因子得到有效降解，其中植酸的降解程度尤為顯著。此外，乳酸片球菌L-19有助于黑豆蛋白水解以釋放出小分子活性肽。感官方面，黑豆酸面團面包L-19的整體可接受度最高，具有良好的烘焙特性。植酸的降解率僅是反映面包營養價值改善的其中一個指標，試驗并未涉及其他相關營養指標的評價，有待進一步探究。