食品中常見病原微生物的DNA條形碼識別技術

鐘文濤 徐 越 王淑好 王芳妹

(1. 國家農副產品質量監督檢驗中心，湖南 長沙 410007；2. 湖南省產商品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410007)

加拿大動物學家Hebert等[1]于2003年提出“DNA條形碼”的概念，希望用“標準化”的基因片段(如COI基因)作為物種快速識別的標記，建立起物種名稱和生物實體之間一一對應的關系。經過10余年的發展，科研人員將DNA條形碼與基因測序技術相結合，在動植物的相似種識別方面已經做了大量工作[2]，在國際上建立了多個與DNA條形碼相關的合作組織和大型數據庫[3]，取得了初步成效。Buddhachat等[4]評估了條形碼技術與傳統形態學鑒定技術在魚類分類上的差異，認為DNA條形碼更為準確、高效；Xing等[5]使用COI基因對中國市場上銷售的各種動物源食品的標簽錯誤問題進行了調查，發現23%的產品標簽存在瑕疵；Liu等[6]為識別中國藥典中有毒藥用植物及其摻假物，對比了4種候選DNA條形碼的識別效率，發現ITS2基因可用作通用條形碼。

對微生物DNA條形碼的研究雖有文獻[7-8]報道，但相較動植物而言則顯得滯后。究其原因是由于微生物具有物種的多樣性和基因的高突變性，找到穩定可靠的保守基因片段作為研究目標具有一定難度[9]。現有文獻[10-11]報道發現適用于原核生物DNA條形碼研究的目標基因有16SrRNA、COI和cpn60，其中16SrRNA在各大數據庫中資源最為豐富，因此對其的研究也相對集中。

在食品檢驗領域，DNA條形碼在肉制品、海產品真實性鑒定上已有應用[12]，但對食品中病原微生物的相關研究尚未開展。研究選擇16S rRNA的V3～V6區域為目標基因片段，對食品中常見病原微生物及其表型類似株的序列進行分析，目的是建立一種基于DNA條形碼技術的快速、準確的識別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Chelex 100：美國Bio-Rad公司；

2×PCR Master mix、DNA Marker、Agarose Gel DNA Extraction Kit：寶生物工程(大連)有限公司；

電泳級瓊脂糖：生工生物工程(上海)股份有限公司；

8種常見病原微生物(見表1)和15種表型類似株(大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、產氣腸桿菌、斯氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、熒光假單胞菌、表皮葡萄球菌)：ATCC、CICC、CMCC菌株庫和廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR儀：C1000 Touch型，美國Bio-Rad公司；

核酸蛋白測定儀：SmartSpec plus型，美國Bio-Rad公司；

電泳儀：powerpac universal型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像系統：GelDoc XR+型，美國Bio-Rad公司；

高速離心機：MiniSpin Plus型，德國Eppendorf公司。

1.3 菌株純化及核酸提取

菌株活化后用非選擇性培養基劃線分離，挑取單個菌落接種增菌肉湯，(36±1) ℃培養(24±2) h。將菌懸液振蕩混勻后，取1.5 mL在8 000 r/min下離心5 min，棄上清液，使用適量的無菌生理鹽水洗菌3次，最后一次離心時盡量吸干剩余液體。在沉淀物中加入30 μL 5%的Chelex 100溶液并使其重新懸浮，然后在100 ℃沸水中保持10 min，立即置于冰上冷卻1 min，12 000 r/min離心10 min，所得上清液作為擴增模板，-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計

16S rRNA包含9個V區(可變區，Variable region)和10個C區(保守區，Conserved region)，且V區和C區交替排列[13-14]。設計DNA條形碼通用引物時應考慮將上下游引物落在C區，中間包含一個或數個V區。在GeneBank中搜索表1中8種病原微生物的16S rRNA基因組編碼序列，選擇盡可能完整的序列，目的是包含所研究的V3～V6區域(起止位置為433～1 043，共計610 bp[15])。將序列導入到DNASTAR軟件中，通過MegAlign功能分析菌種間16SrRNA基因的同源性和變異性，用Primer Premier 6設計適合在不同菌種間擴增的通用引物。共測試了兩對通用引物(表2)，其中通用引物1為項目組自行設計，通用引物2為項目組對文獻[15]中的引物進行改良所得。引物序列由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 PCR擴增

通用引物PCR反應在20 μL體系中進行：2×PCR Master mix 10 μL、10 μmol/L正反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，無菌水8 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，循環35次，72 ℃再延伸5 min。取5 μL反應產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統分析擴增產物。將瓊脂糖凝膠上的電泳條帶切下，按照瓊脂糖DNA純化試劑盒說明書進行提取純化后，送至寶生物工程(大連)有限公司進行基因測序鑒定。

1.6 數據處理

將測序所得的序列除去首尾各30 bp堿基，選擇合適的數據庫進行序列比對。GenBank是最為常用的比對數據庫，序列資源非常豐富，但其質量良莠不齊；而RDP是基于細菌和真菌的核糖體序列信息建立的專業數據庫，最新版本已包含3 356 809條16S rRNA信息，可提供足夠可靠的比對信息。采用GenBank的Blastn功能，結合RDP的Classifier和Sequence Match功能，對測序結果進行綜合分析。

表1 菌種信息及其16S rRNA序列片段編號

表2 通用引物序列

1.7 干擾菌測試

按照1.3中描述的試驗步驟，對15種干擾菌進行純化并提取核酸。使用表2中的2對通用引物分別進行PCR擴增，后續PCR擴增按照1.5中所述的步驟進行，數據處理按照1.6中所述執行。

2 結果與分析

2.1 電泳圖譜

由于所擴增的23種測試菌株分別屬于4個“目”、6個“科”及11個“屬”，為了實現擴增效率的最大化，在設計通用引物時使用了簡并堿基。從圖1和圖2可以看出，試驗條件下，通用引物1和2對所有目標片段均進行了有效的擴增，電泳條帶清晰明亮，大小符合預期，沒有發生引物二聚體的現象，說明通用引物的適用性較強。

2.2 序列比對

經比對，在GenBank數據庫中，通用引物1擴增的序列Percent Identity最低值為97.96%，通用引物2擴增的序列Percent Identity最低值為98.91%；經RDP數據庫的Classifier檢索，所有序列的“門、綱、目、科、屬”信息匹配率為100%，通用引物1擴增的序列在Seqmatch score最低值為0.983，通用引物2擴增的序列在Seqmatch score最低值為0.972。

因此，不論是在GenBank數據庫還是在RDP數據庫進行檢索，序列的匹配率均符合預期值，所有菌種的序列均能準確鑒定到“屬”水平，部分能準確鑒定到 “種”水平(見表3)。通用引物1和通用引物2的擴增產物雖然長度相差近300 bp，但是對試驗所涉及的目標菌的識別能力基本一致，僅在福氏志賀氏菌的比對結果上存在差異。

1～9泳道分別為DNA Marker、鼠傷寒沙門菌、阪崎腸桿菌、福氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌

2.3 菌種識別

根據表3所列信息，對8種常見的病原微生物及相關15種表型類似菌株按所屬“目”“科”進行分類后，統計DNA條形碼序列在不同分類水平上的菌種識別能力，如圖3、4所示。可以發現，16S rRNA的V3～V6區域能較好地鑒別弧菌目、假單胞菌目和芽孢桿菌目的葡萄球科相關菌種，可明確區分其中的致病菌和非致病菌；而對芽孢桿菌目中的李斯特氏菌科、芽孢桿菌科中的相關菌種只能鑒別到“屬”水平，還需要借助其他技術手段才能達到區分的目的；對腸桿菌科目腸桿菌科的菌種識別中，沙門氏菌屬和志賀氏菌屬不能鑒定到“種”水平，但可以明確區分腸桿菌科的其他屬，由于食品中分離出的沙門氏菌屬和志賀氏菌屬均屬于致病菌范疇，因此也能達到病原微生物識別的目的。

部分菌種僅能識別到“屬”水平，在“種”水平給出了多個可能的鑒定結果，可能由于這些菌種在V3～V6區域的序列過于近似，引物設計時可考慮擴增其他一個或幾個可變區域。

DNA條形碼結合基因測序技術極大地提高了物種分類學的準確性和高效性[16-17]，其最大優勢在于可以實現對未知物種的識別。目前，基因測序技術已經發展到了第三代，每一代技術各具優勢，應用場景也存在差異。例如高通量測序可快速實現對環境樣品中微生物進行宏觀普查，節約了大量時間、人力成本，但同時由于得到的信息量大，干擾數據多，因此針對性不強。而試驗建立的方法其成本和技術門檻較低，試驗結果無需生物信息學專業人士分析，適用于普通實驗室中單一樣品或單一菌落分析。

但是，在DNA條形碼試驗設計及執行過程中有以下幾點需要引起重視：① 不同物種間通用引物的設計需要考慮的因素較多；② 對純化后的核酸質量(如純度、濃度)要求較高，否則會出現套峰或無法檢測的情況；③ 測序長度一般控制在400～800 bp的范圍內，且首尾20 bp左右的序列由于準確度較差，需舍去后再進行數據庫比對；④ 菌種的16S rRNA數據庫信息需進一步更新、完善，以增加菌種識別的范圍和準確度。

1～16泳道分別為DNA Marker、大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、產氣腸桿菌、斯氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、熒光假單胞菌、表皮葡萄球菌

表3 序列比對結果

圖3 “目”水平的菌種識別

圖4 “科”水平的菌種識別

3 結論

中國現行食品安全檢驗標準體系中涉及病原微生物的檢測均為針對某一指定菌種進行分離鑒定，強調檢驗結果的特異性，而對產品中可能存在的其他微生物風險無法全面覆蓋。試驗基于細菌的16S rRNA，對DNA條形碼在食品生物安全領域的應用進行了探索。依照試驗設計，選擇V3～V6區域作為目標片段，對變形桿菌綱(腸桿菌目、弧菌目、假單胞菌目)具有足夠的分辨率，能準確識別食品中的致病菌和相關干擾菌，而對芽孢桿菌綱(芽孢桿菌目)的鑒定將范圍縮小到了“屬”水平，減輕了進一步識別的工作量。在食品病原微生物研究范疇內，COI、cpn60或其他基因片段是否能實現更高的識別效率，還有待進一步驗證。DNA條形碼技術能實現在較低的技術平臺上對未知微生物的無靶標識別，極大地方便了企業查因溯源及監管機構開展風險評估。