一株特丁津降解菌(短小芽孢桿菌TDJ-ZJ03)的分離

彭邦良

(寧波至誠學校，浙江 寧波 315033)

1 引言

特丁津是一種重要的s-三嗪類除草劑，主要用于玉米、高粱和豆類等作物生產過程中落葉和闊葉雜草的防治。長期且廣泛的使用特丁津已經導致其在土壤中有很高水平的殘留，并容易通過雨水徑流和滲漏進一步造成水體污染[1]。此外，特丁津已被確定為一種內分泌干擾物，它也不易于降解且對微生物有毒性。因此，將特丁津從污染場所中快速清除對于環境安全至關重要[2]。

近年來，已有利用微生物修復受特丁津污染的土壤的成功案例，微生物修復技術因其低成本和環境友好性已成為環境修復領域的開發熱點[3]。然而，微生物修復方法需要獲得高效的純菌株或菌群，并有成熟的應用方法；此外，許多因素通常會影響特丁津的生物降解，如溫度、pH值以及周圍基質的含氧量等[4]。因此，除了篩選高效降解菌株或菌群外，還應關注各種環境因素對特丁津生物降解的影響。本研究從土壤中分離到一株能高效降解特丁津的菌株，并對其降解潛力及在環境保護中的應用進行了研究。

2 材料和方法

2.1 化學試劑與培養基

化學試劑：特丁津(99.1%)購自Sigma-Aldrich公司；所使用的其他化學試劑均為分析純級。

培養基：①無機鹽培養基：七水硫酸鎂 0.2 g，硫酸銨 0.1 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鈣 0.05 g，七水硫酸亞鐵 0.01 g，蒸餾水1.0L，pH值7.0。②分離培養基：以含有特丁津的無機鹽培養基(特丁津濃度為50 mg/L)作為分離培養基，用于分離特丁津降解菌。③富集培養基：蛋白胨7.0 g，酵母膏5.5 g，牛肉膏粉4.0 g，氯化鈉5 g，水1.0L，pH值7.0。

2.2 特丁津降解菌的分離與鑒定

土壤樣品取自寧波市農田，取樣農田有特丁津應用史。將5.0 g土壤樣品溶入到100 mL分離培養基中，在30 ℃下振蕩培養(100 rpm)，每隔12 h測定特丁津濃度。若測得的3天降解效率>70%，則將5 mL培養液轉移到含有相同濃度特丁津的富集培養基中，連續轉移培養5次以上。再次確認降解能力后，將上述富集培養基涂布在含特丁津的無機鹽培養平板上，在30 ℃下倒置培養，挑選生長旺盛的菌落，在培養平板上反復劃線，得到純培養物。應用16S rRNA基因序列分析方法對新分離菌株進行菌種鑒定(測序及其相關工作由上海生工公司完成)。

2.3 菌株TDJ-ZJ03對特丁津的降解

將菌株菌株TDJ-ZJ03接種到富集培養基中，在35 ℃下振蕩培養(100 r/min)。隔夜培養后通過離心收集細菌菌體，用無菌生理鹽水淋洗后進行重懸，濃度約為5×105個/mL；此細菌懸液將作為后續實驗的接種體。將6 mL的菌株TDJ-ZJ03接種體接種到150 mL含有特丁津的無機鹽培養基中(培養基中特丁津濃度為50 mg/L)，然后振蕩培養(100 r/min，35 ℃)。每隔12 h測定特丁津的濃度。

2.4 溫度對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

將6 mL的菌株TDJ-ZJ03接種體接種到150 mL含有特丁津的無機鹽培養基中(特丁津濃度為50 mg/L)，分別置于不同溫度下培養，每間隔12h測定OD600。

2.5 pH值對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

將含有特丁津的無機鹽培養基(特丁津濃度為50 mg/L)的pH值調至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。然后，在不同pH值的培養基中接種菌株TDJ-ZJ03；在35 ℃下培養，定時測定OD600。

2.6 菌株TDJ-ZJ03對特丁津的耐受性

在無機鹽培養基中添加特丁津，將特丁津的濃度分別調整為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L，接種菌株TDJ-ZJ03后在35 ℃下振蕩培養， 并定時測定OD600，用以評價菌株TDJ-ZJ03對特丁津的耐受性。

2.7 菌株TDJ-ZJ03對土壤中特丁津的降解

取農場新鮮土壤，分為4組：①滅菌土壤(121 ℃滅菌30 min)；②新鮮土壤；③滅菌土壤中添加TDJ-ZJ03：每100 g滅菌土樣中加入8 mL接種液；④ 新鮮土壤中添加TDJ-ZJ03：每100 g新鮮土壤樣品中添加8 mL接種液。將無菌特丁津加入各組后(特丁津最終濃度為50 mg/kg)，將樣品置于35 ℃下孵育。在此過程中，土壤含水量控制在40%左右(v/v)，并定時測定土壤中特丁津的濃度。

3 結果與討論

3.1 一株特丁津降解菌的特征描述以及菌株TDJ-ZJ03對特丁津的降解

從土壤中分離到一株能以特丁津為唯一碳源和能源的細菌，命名為TDJ-ZJ03。菌株TDJ-ZJ03為桿菌，大小0.4～0.5μm×1.5～2.0μm，革蘭氏陽性，有芽孢，運動型，兼性好氧，在營養肉湯平板上形成不透明的灰白色菌落。氧化酶和過氧化氫酶試驗呈陽性，而硝酸鹽還原、葡萄糖發酵、尿素酶和淀粉酶試驗呈陰性。依據16S rRNA序列分析，菌株TDJ-ZJ03被鑒定為短小芽孢桿菌(16S序列分析委托上海生工生物工程公司完成，GenBank登錄號MW131454)。圖1中的結果表明:菌株TDJ-ZJ03可以快速降解特丁津；菌株TDJ-ZJ03對特丁津(50 mg/L)的3 d降解率達到約84.6%。

3.2 溫度和pH值對菌株TDJ-ZJ03的影響

在35℃時，菌株TDJ-ZJ03的生長水平最高，其次是40 ℃，溫度過高或過低都會抑制菌株TDJ-ZJ03的生長(圖2)。在30 ℃時，菌株TDJ-ZJ03的生長略有下降，但仍處于較高水平。25 ℃或45 ℃時對菌株TDJ-ZJ03的生長影響較大，但也不會導致其生長停止。一般來說，溫度能直接影響微生物的生長和降解酶的活性；在適宜的溫度下，微生物能更有效地降解污染物。 基于以上實驗結果，認為35～40 ℃是菌株TDJ-ZJ03生長的適宜溫度。

圖2 溫度對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

環境pH值也是影響微生物生長的重要因素，圖3的實驗結果表明：菌株TDJ-ZJ03在pH值7.0～7.5下的生長狀況優于在其他pH值條件下。因此，認為菌株TDJ-ZJ03生長和降解特丁津的適宜pH值為7.0～7.5。一般而言，pH值不僅通過影響微生物生長而引起生物降解能力的變化，而且能直接影響相關降解酶的活性[5]。此外，pH值還與一些降解酶基因的表達密切相關。

圖3 pH值對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

3.3 菌株TDJ-ZJ03對特丁津的耐受性

隨著特丁津濃度從25 mg/L增加到100 mg/L，菌株TDJ-ZJ03的OD600逐漸增加。但當特丁津濃度增加到200 mg/L時，菌株TDJ-ZJ03的生長量較100 mg/L時有少許降低；如進一步增加到500 mg/L，其生長則受到了顯著的抑制，但并不會導致生長停止(圖4)。菌株TDJ-ZJ03的OD600在特丁津濃度為25 mg/L或50 mg/L時會較濃度為100 mg/L時低，這可能是因為25 mg/L(或50 mg/L)的特丁津不能滿足菌株TDJ-ZJ03生長所需的碳源或能量需求。因此，初步認為菌株TDJ-ZJ03在實驗條件下至少能耐受濃度為500 mg/L的特丁津。根據現有的研究結果，推測菌株TDJ-ZJ03對特丁津有很強的降解能力，有望用于降解較寬濃度范圍內的特丁津。

圖4 不同濃度的特丁津對菌株TDJ-ZJ03生長的影響

3.4 特丁津在土壤中的降解

圖5中的試驗數據表明，添加菌株TDJ-ZJ03到土壤中用以加速特丁津的降解是可行的。將菌株TDJ-ZJ03添加到土壤中，能顯著提高土壤中特丁津的降解效率；在新鮮土壤或滅菌土壤中添加菌株TDJ-ZJ03后，特丁津(50 mg/kg)在5 d內的降解率能分別達到98.4%和94.4%。而在未添加菌株TDJ-ZJ03的土壤中，新鮮土壤和滅菌土壤在5 d內的降解率分別僅為31.6%和4.8%。因此，也可認為菌株TDJ-ZJ03在土壤中具有良好的生存和繁殖能力，并能有效發揮降解特丁津的功能。另外，圖5的數據還表明，新鮮土壤中特丁津的降解效率高于滅菌土壤中的降解效率，這可能是因為新鮮土壤中的某些天然微生物參與了特丁津的降解或對降解起到了一些輔助作用[6]。

圖5 在不同處理的土壤中特丁津的降解曲線

4 結語

從土壤中分離得到的短小芽孢桿菌TDJ-ZJ03能高效降解特丁津，在培養基中對特丁津(50 mg/L)的3 d降解率約為84.6%。菌株TDJ-ZJ03生長的最適pH值為7.0～7.5、適宜溫度為35～40 ℃；另外，菌株TDJ-ZJ03對特丁津也有很高的耐受性，至少能夠耐受濃度為500 mg/L的特丁津。將菌株TDJ-ZJ03施用于土壤中能有效促進特丁津的降解，推斷菌株TDJ-ZJ03可用于特丁津污染的治理。