紫外光促進苦蕎中黃酮類化合物積累的分子機制探究

朱智慧,溫 東,張 棟晁二昆,董剛強,杜 偉,孫 偉Krzysztof Dziedzic,師玉華*,薛建平*

1.中國中醫科學院中藥研究所，中藥鑒定與安全性評估北京市重點實驗室，北京 100700

2.淮北師范大學生命科學學院，安徽 淮北 235000

3.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040

4.安利（中國）植物研發中心，江蘇 無錫 214115

5.安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102

6.波茲南生命科學大學 植物源食品技術系，波蘭 波茲南 31,60-624

苦蕎Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn 為雙子葉蓼科蕎麥屬植物，是一種重要的雜糧作物和藥食同源植物，在我國西南地區分布廣泛[1-2]?？嗍w中富含黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等較好的藥理作用。其中蘆丁是苦蕎中特有的黃酮類化合物，具有降低毛細血管通透性，改善微循環，改善脂質代謝及調血脂等作用[3]。早在20世紀40年代中期，苦蕎麥就被用作藥用蘆丁的重要來源，因此，苦蕎麥中蘆丁等黃酮類化合物合成及調控研究尤為重要[4]。

苦蕎中黃酮類化合物的生物合成途徑及其關鍵的合成酶研究已經比較清晰。該合成途徑屬于苯丙烷代謝途徑（phenylpropanoid pathway）。首先，由苯丙氨酸經過苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸:輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）3步酶促反應生成起始前體香豆酰-CoA[5]。然后，在查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）催化下轉化為柚皮素[6]。柚皮素是該途徑的主要代謝產物，之后進入不同的合成分支途徑。其中一個分支經過黃烷酮-3-羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F3H）、黃酮醇合成酶（flavonol synthase，FLS）和F3H 形成槲皮素，最后經類黃酮糖基轉移酶（ flavonoid glycosyltransferas，GTR）催化形成蘆?。涣? 個分支由二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）、花青素復原酶（anthocyanidin reductase，ANR）進一步還原生成兒茶素（catechin），或經無色花色素還原酶（leucoanthocyantin reducase，LAR）催化形成表兒茶素（epicatechin）[7-8]。

植物次生代謝受遺傳因素、生物因素和溫度、光和水等非生物因素影響[9]。其中紫外光在植物光形態建成、次生代謝和葉色形成方面具有重要作用[10-11]。研究發現，植物在受到紫外光輻射時本身會產生大量的次生代謝物質來抵御紫外光的損害，這些次生代謝物質包括苯丙素類化合物、酚類、生物堿、萜類化合物等[12-13]。例如，紫外光照射處理番茄顯著提高了其中沒食子酸、綠原酸、丁香酸、對香豆酸和槲皮素等酚類單體的含量[14]；紫外光照能夠促進黃芪中異黃酮類化合物的積累[15]。目前，有研究報道紫外光處理影響苦蕎中黃酮類化合物的含量[16]，但是紫外光尤其是紫外線B（ultraviolet radiation B，UVB）在苦蕎中影響蘆丁等黃酮類化合物代謝的調控機制尚不清楚。本研究擬用UVB處理苦蕎幼苗，通過超高效液相色譜儀檢測紫外光處理前后苦蕎中蘆丁等黃酮類化合物含量變化，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測苦蕎中黃酮類化合物合成通路中關鍵酶基因的表達量，初探紫外光照射對苦蕎中黃酮類化合物的積累及其分子機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

苦蕎Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn 種子選用晉蕎2 號，由貴州師范大學陳慶富教授鑒定并提供。對照品蘆?。–AS 號153-18-4）、兒茶素（CAS 號154-23-4）、表兒茶素（CAS 號490-46-0）均購自于Chemfaces 公司，質量分數均大于98%。

1.2 儀器

UPLC-MS 系統，包括1290 系列超高效液相色譜儀、6470 型三重四極桿質譜儀購自安捷倫科技有限公司；qTOWER3G 實時熒光定量PCR 儀購自德國耶拿分析儀器股份公司；BS210S 型1/1 萬電子分析天平購自德國賽多利斯公司；紫外燈管UVB（275～320 nm，UVB10.0-43B）購自廣東華強電器集團有限公司；DS-11 超微量紫外/可見分光光度計購自于美國Denovix 公司。

2 方法

2.1 UVB 處理

選取籽粒飽滿的苦蕎種子，浸泡水中約8 h 后用鑷子種入土壤中，25 ℃黑暗生長6 d。然后取一部分苦蕎幼苗放置在紫外燈UVB（波長275～320 nm，光照強度2 W/m2）下處理6、12、24 h，另一部分苦蕎幼苗仍在黑暗下生長，作為對照組。每個處理取10 株幼苗，做3 個生物學重復。最后，將處理組和對照組材料編號收集，液氮速凍后存放于?80 ℃冰箱待測。

2.2 黃酮類化合物含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、兒茶素、表兒茶素的對照品1 mg，加入1000 μL 70%甲醇，制成質量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將UVB 和對照處理后的苦蕎幼苗進行液氮冷凍研磨成粉。用分析天平精確稱量0.1 g 樣品粉末，加入1000 μL 70%的甲醇提取劑進行提?。蝗缓髮⒅苽錁悠?500 r/m 渦旋3 min，超聲30 min，12 000 r/min 離心10 min；離心后的樣品取上清，用0.22 μm 有機濾膜過濾樣品；最后裝入進樣瓶，并將樣品進行稀釋。檢測蘆丁含量時，樣品稀釋1000 倍，檢測兒茶素、表兒茶素時，樣品稀釋10 倍，備用，待測。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～3.5 min，10%～45%B；3.5～3.6 min，45%～90%B；3.6～4.5 min，90%B；4.5～4.6 min，90%～10%B；4.6～6.0 min，10%～10%B。體積流量0.3 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (A) 和供試品 (B) 的UPLC 圖Fig.1 UPLC chromatogram of standard solution (A) and sample (B)

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取各對照品儲備液，加 70%甲醇稀釋成梯度濃度，進樣檢測，記錄色譜峰面積，以對照品溶液的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。對苦蕎中3 種黃酮類化合物蘆丁、兒茶素和表兒茶素進行線性考察，r2值均大于0.999（表1）。

表1 標準曲線方程Table 1 Standard curve of reference materials

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下制備的1 mg/mL的對照品溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件連續進樣6 次，結果顯示3 種化合物的對照品峰面積的RSD 在0.71%～1.75%。

2.2.6 重復性試驗 取“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜峰面積，結果顯示，3 種化合物質量分數的RSD 在0.95%～2.05%，表明方法具有良好的重復性。

2.2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，于室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，按照“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄 3種化合物的峰面積，結果峰面積的 RSD 為在0.76%～2.15%。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已測定的苦蕎樣本9份，每份約0.05 g，精密稱定，分別精密加入低、中、高濃度（按50%、100%和150% 3 個水平）的蘆丁、兒茶素和表兒茶素對照品溶液，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行3 份，再按照“2.2.3”項下色譜條件進樣檢測，計算加樣回收率。結果顯示3 個化合物的加樣回收率在95.82%～105.65%，RSD 均小于0.3%。

以上結果表明本研究建立的檢測方法精密度高、準確度好、方法穩定，可有效用于苦蕎中這3個化合物的檢測。

2.3 RNA 提取和cDNA 制備

取苦蕎苗100 mg,按照TaKaRa 公司MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取試劑盒（9769）說明書提取總RNA。用DS-11 超微量紫外分光光度計（美國 DeNovix 公司）檢測RNA 濃度。取2.5 μg總RNA，按照PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（6210A），進行第一鏈cDNA的合成，?20 ℃貯存待用。

2.4 qRT-PCR 檢測

選用PAL、C4H、CHS、CHI、FLS等11 個黃酮合成途徑的關鍵酶基因[6]。qRT-PCR 引物使用Primer 5.0 軟件設計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR 所用基因名稱、基因ID、引物序列、擴增片段長度等信息詳見表2。qRT-PCR 反應按照試劑盒Trans Start Green qPCR Super MixUDGG（北京全式金生物技術有限公司 TransGen Biotech）說明書進行。選取Histone H3（JF769134）作為內參基因[17]，每個樣品3 次重復，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表2 實時定量PCR 引物Table 2 Primers of quantitative PCR in this study

圖1 UVB 處理后苦蕎幼苗表型Fig.1 Morphological responses of tartary buckwheat seedlings under UVB radiation

3 結果與分析

3.1 UVB 處理后苦蕎苗表型及黃酮類化合物變化

為了探究紫外光對苦蕎苗中黃酮類化合物積累的影響，對黑暗培養6 d 的苦蕎幼苗進行紫外光UVB 處理。實驗結果發現，UVB 照射處理6 h 后的苦蕎苗幼苗生長狀態良好，且表現出一些光形態建成的表型（圖1），但隨著紫外照射時間延長，苦蕎苗受到紫外損傷，開始萎蔫。因此，本研究選用紫外光UVB 處理6 h 苦蕎苗進行黃酮類化合物含量變化。進一步，本實驗檢測紫外光UVB 處理前后苦蕎中這3 種黃酮類化合物的含量變化。結果發現紫外光UVB 處理6 h 后苦蕎幼苗中蘆丁、兒茶素、表兒茶素均出現不同程度的積累，其中蘆丁含量為對照組的1.5 倍（圖2-A），兒茶素和表兒茶素含量均約為對照組的1.3 倍（圖2-B、C）。顯著性分析表明，紫外光UVB 照射后苦蕎幼苗中蘆丁、兒茶素的含量與對照組相比呈極顯著增加；表兒茶素與對照組相比呈顯著增加。

圖2 UVB 處理后苦蕎中蘆丁 (A)、兒茶素 (B)、表兒茶素(C) 含量變化Fig.2 Changes in contents of rutin (A),catechin (B) and epicatechin (C) in Tartary buckwheat under UVB radiation

3.2 紫外光UVB 處理后苦蕎黃酮合成途徑中關鍵基因表達量變化

本研究進一步分析苦蕎幼苗中黃酮類合成通路上關鍵基因CHS1、CHS2、C4H、F3H、DFR、F3′H、CHI、4CL、PAL、FLS、GTR的相對表達量，探究紫外光對苦蕎苗中黃酮類化合物的合成和積累的影響機制。qRT-PCR 結果發現，與對照組相比，紫外光UVB 處理后黃酮類合成通路上關鍵基因相對表達量均有上調（圖3-A）。其中F3′H和4CL基因的表達量顯著上升，約為對照組的8 倍，CHS1和DFR基因的相對表達量約為對照組的6 倍，其他基因的表達量與對照組相比也均上調2～3 倍（圖3-A）。黃酮合成途徑見圖3-B。

4 討論

本研究通過UVB 照射苦蕎幼苗，發現苦蕎中蘆丁、兒茶素、表兒茶素3 種黃酮類化合物含量均有不同程度的增加。雒曉鵬等[18]用紫外光照射苦蕎幼苗，用紫外-分光光度法檢測發現處理3 d的苦蕎苗與普通光照對比總黃酮類含量顯著增加，與本研究得出的結果一致。因此，紫外光UVB 有利于促進苦蕎中黃酮類化合物的積累。張繼斌等[19]對主產地云南、貴州、陜西、四川的苦蕎黃酮類成分的含量分析比較，結果發現紫外光較強的云南產地的苦蕎中槲皮素等黃酮類明顯高于其他產地[20]。因此，推測苦蕎在受到紫外光脅迫時，機體會通過積累大量的黃酮類物質來抵御紫外光的輻射傷害，紫外光可能是促進苦蕎中藥用成分蘆丁等黃酮類化合物累積的關鍵環境因子之一。

圖3 UVB 處理后黃酮合成途徑中關鍵基因表達量變化(A) 及合成途徑 (B)Fig.3 Expression changes of genes involved in flavonoid synthesis pathway under UVB radiation

2017年，Zhang 等[7]發表了苦蕎的基因組，為苦蕎黃酮類化合物合成調控機制的研究奠定了基礎。本研究篩選了黃酮合成途徑中的11 個關鍵酶基因，通過qRT-PCR 檢測發現，這11 個關鍵基因的表達量均有不同程度的上升。其中，蘆丁合成支路上的重要關鍵酶F3′H、FLS、GTR 等明顯上調，這與紫外光UVB處理后苦蕎幼苗中蘆丁含量上升的結果相對應；此外，實驗還發現花青素/原花青素合成支路上的關鍵酶基因DFR 的表達量上升了6 倍，這也就解釋了紫外光UVB 處理后苦蕎幼苗中兒茶素和表兒茶素含量增加的原因。進一步分析黃酮合成途徑上游的一些關鍵酶基因的變化，發現PAL、C4H、4CL、CHS1、CHS2、CHI 6 個上游的基因也均有不同程度的表達上升，說明紫外光UVB 照射不僅是影響了苦蕎黃酮類化合物合成途徑中個別基因的表達，而是誘發了整個苦蕎黃酮類化合物合成途徑中從上游到下游多個基因的表達上調，從而促進苦蕎體內蘆丁、兒茶素和表兒茶素等多個黃酮類化合物的積累。有研究表明黃酮類化合物的合成與bHLH（basic helix-loop-helix）、bZIP（basic region-leucine zipper）、MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）等家族的轉錄因子的調控密切相關[21-24]。研究發現玉米中的MYB P1和P2通過與黃酮合成途徑的關鍵酶CHS、CHI1 和DFR 等主要靶基因結合影響黃酮類化合物的合成[25]。Zhang 等[26]研究也發現苦蕎FtMYB116 通過與F3′H 的啟動子結合，促進苦蕎中蘆丁等化合物的累積。然而，苦蕎是如何響應紫外光UVB 照射，又是通過與哪些調控因子互作來調控體內黃酮類化合物積累的，這些機制尚不清晰，有待于進一步的研究。植物的次生代謝調控是一個復雜的、動態的過程，本研究發現紫UVB 能夠通過正調控苦蕎黃酮合成途徑中多個基因的表達從而促進蘆丁、兒茶素、表兒茶素等化合物的積累，為進一步理解苦蕎中蘆丁等黃酮類化合物的調控奠定基礎，同時也為苦蕎的育種提供了科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突