蠶蛾公補合劑對少弱精子癥患者精液Wnt/β-catenin信號通路的影響

趙 珂，趙 玉，陳少峰，李 重，孫 遠，王 福，耿 強*

1.天津市中醫藥研究院附屬醫院 婦科，天津 300091

2.天津中醫藥大學第一附屬醫院 男科，天津 300193

3.中國中醫科學院西苑醫院 男科，北京 100091

男性不育癥是影響社會穩定及家庭和諧的全球性問題[1]，世界范圍內有7000 萬對夫妻存在生育力低下或不育的狀況[2]，其中接近40%由男方因素引起[3]。少弱精子癥是引起男性不育癥的重要因素之一，目前現代醫學針對少弱精子癥的治療無特效藥物[4]，亦或選擇輔助生殖技術孕育子代，但仍存在高成本、患者接受度低以及后續子代健康風險等諸多問題。中醫藥治療男性不育癥歷史悠久，積累了大量的臨床經驗并取得了較好的療效，如以補腎益精為主要功效的中成藥五子衍宗丸可改善精子質量，治療少弱精子癥[5]。蠶蛾公補合劑是一種以名貴藥材雄蠶蛾提取物為君藥配伍制成的現代中藥制劑，具有補腎助陽、養血填精之功效，同時現代研究發現 Wnt（一類分泌性糖蛋白）/β-鏈蛋白（β-catenin）信號通路參與睪丸的生精過程[6]。本研究擬通過運用蠶蛾公補合劑治療少弱精子癥患者，評價其臨床療效并探討其作用機制，為中醫藥治療少弱精子癥提供臨床參考和試驗依據。

1 研究對象

1.1 病例選擇

選取2018年1月—2019年12月就診于天津市中醫藥研究院附屬醫院、天津中醫藥大學第一附屬醫院和中國中醫科學院西苑醫院門診患者60 例，入組前均簽署知情同意書，將納入患者按照隨機數字表法隨機分為治療組及對照組，每組30 例，平均年齡（29.50±3.26）歲，平均病史（16.10±3.34）月。兩組基線資料間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本實驗通過中國中醫科學院西苑醫院實驗倫理審查委員會審批（批準號2018XLA084-2）。

1.2 納入標準

（1）符合西醫診斷標準，包括男性不育癥和少弱精子癥的診斷。診斷標準參考《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版。男性不育癥：在未采取避孕措施情況下，同居1年或1年以上，配偶未懷孕，并排除女方因素。少精癥：精子濃度低于下限值即1.5×107/mL；弱精子癥：表現為精子活力降低，前向運動精子活動率＞10%，且＜32%。（2）符合中醫腎陽虛的診斷標準。參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[7]，主癥：腰膝酸軟，性欲減退，畏寒肢冷；次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢浮腫，動則氣促，發槁齒搖，舌質淡苔白，脈沉遲，尺無力。具備以上主癥2 項，次癥2項，即可診斷腎陽虛證。（3）20 歲＜年齡＜40 歲。（4）患者存在2 次及以上精液異常。（5）所有患者均在本研究治療前2 周內未服用任何避孕藥。

1.3 排除標準

（1）近期服用過腫瘤化療藥、柳氨磺胺吡啶、呋喃妥英等對精子生成、活力具有影響的藥物；（2）存在嚴重肝、心等系統性疾病；（3）存在藥物過敏史；（4）存在中、重度附屬性腺或生殖道感染。

2 方法

2.1 給藥方案

治療組給予蠶蛾公補合劑（批號2017011，太極集團四川南充制藥有限公司），口服3 次/d，每次10 mL。對照組給予口服五子衍宗丸（60 g/瓶，水丸制劑，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號Z11020241），每次6 g，2 次/d，兩組均以12周為1 個療程，治療1 個療程。

2.2 療效標準

顯效：精子數量及精子活力增加2/3；有效：精子數量及精子活力增加1/3；無效：精子數量及精子活力增加不明顯或降低；總有效率＝(顯效例數＋有效例數)/總例數。

2.3 精液常規指標檢測

囑受試者禁欲2～7 d，采用手淫取精液，液化后做精液常規分析，采用精液全自動分析系統（北京偉力科技有限公司生產）進行精子密度和精子活力的分析。剩余標本在低速水平離心機（北京白洋醫療器械有限公司）中以3000×g離心15 min，用一次性吸管進行精漿及精液沉淀物分離，分別放置在潔凈EP 管內，冰箱?4 ℃冷凍層內保存待用。

2.4 RT-PCR 檢測Wnt/β-catenin mRNA 表達

液氮保存組織解凍，移入研缽中，加入1 mL TRIzol，反復研磨，將勻漿樣品在室溫放置5 min；于2～8 ℃、10 000 r/min 離心10 min，取上清；每使用1 mL TRIzol 加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；2～8 ℃ 10 000 r/min 離心15 min。樣品分為黃色有機相、無色水相和中間層。將水相轉移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。移去上清，用75%乙醇洗滌RNA 沉淀。2～8 ℃不超過7500 r/min 離心5 min，棄上清；室溫放置干燥或真空抽干RNA 沉淀，晾5～10 min。加入25～200 μL無RNase 的水或0.5% SDS，用槍頭吸打幾次，55～60 ℃放置10 min 防止RNA 溶解，?70 ℃保存。以U6 作為內參對照，使用SYBR 熒光染料試劑盒進行熒光定量 PCR 檢測，采用 2???Ct方法對Wnt/β-catenin mRNA 的相對表達量進行分析。

2.5 Western blotting檢測Wnt/β-catenin蛋白表達

取液氮保存的組織解凍，與裂解液一起加入研磨器中，冰上研磨裂解10 min，移入離心管中，在超速冷凍離心機中4 ℃、14 000 r/min 離心15 min，收集上清于Eppendorf 管中，BCA 法測定總蛋白濃度，將蛋白樣品與蛋白電泳上樣緩沖液混合，沸水煮10 min，備用。采用Western blotting 法檢測：10%SDS-PAGE 凝膠電泳，使用多功能電泳儀將蛋白轉移至PVDF 膜，將該膜在室溫下封閉2 h，PBST 液漂洗3 次，每次10 min，與一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，PBST 漂洗3 次，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶1000）孵育2 h，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，ECL 化學發光顯影。用Jmage 分析軟件掃描雜交條帶灰度值。結果用目的蛋白條帶與肌動蛋白（Actin）條帶灰度值的比值表示，并且使用Actin 進行校正。

2.6 統計學方法

采用SPSS19.0 統計軟件進行分析，計量資料采用±s表示，數據符合正態分布，t檢驗兩組間差異。

3 結果

3.1 病例脫落情況

本研究納入60 例患者，試驗完成時，兩組均沒有病例脫落，患者依從性好。

3.2 兩組療效比較

治療組總有效率高于對照組，但無統計學差異，即蠶蛾公補合劑與五子衍宗丸治療總有效率無明顯差異。結果見表1。

3.3 精子質量情況變化

對照組和治療組較服藥前，精子密度和精子活力均顯著增加（P＜0.01）；治療后，與對照組比較，治療組精子密度和精子活力顯著增加（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組患者療效比較Table 1 Comparison of efficacy between two groups

表2 精子質量變化Table 2 Change of sperm quality

3.4 精液中Wnt/β-catenin mRNA 和蛋白表達情況

與對照組相比，治療組精液中Wnt/β-catenin mRNA 和蛋白表達增加，差異顯著（P＜0.01）。見圖1、2。

3.5 不良反應

治療組患者中出現1 例惡心、胃脘不適癥狀，經抑酸護胃等對癥治療后消失。對照組未出現嚴重不良反應，兩組均無因不良反應退出本次臨床觀察的情況。

4 討論

圖1 精液中Wnt/β-catenin mRNA 表達情況Fig.1 Expression of Wnt/β-catenin mRNA in sperm

圖2 精液中Wnt/β-catenin 蛋白表達情況Fig.2 Expression of Wnt/β-catenin protein in sperm

中醫學對男性不育癥的認識已有數千年歷史，屬“精冷”“無子”范疇。《黃帝內經》中就記載了以天癸為媒介，以腎為中心的經典生殖學說，并沿用至今。腎為先天之本，主生殖，腎中陽氣不足，命門火衰以致無力生發腎中陽氣以生精，可引起男子精冷、精少而不嗣，故在治療時以補腎作為治療少弱精子癥的基本法則[8]。另有報道顯示，現代男性不育癥的主要證型以腎陽虛證為主[9]。蠶蛾公補合劑由雄蠶蛾、人參、熟地黃、當歸、補骨脂、枸杞子、菟絲子、仙茅、肉蓯蓉、淫羊藿、蛇床子組成，具有補腎壯陽、養血填精之功效。蠶蛾由蠶蛹蛻皮羽化而成，成蟲期的雄性蠶蛾生殖器官十分發達[10]，同時亦可藥用，《本草述鉤元》中記載：“雄蛾，味咸，氣溫熱，主益精氣，止泄精尿血，治遺精赤白濁”，故本方以雄蠶蛾固精壯陽為君藥，人參、熟地黃、補骨脂益氣補腎助陽，共為臣藥；佐以當歸活血補血，枸杞子滋陰填精，仙茅、菟絲子、肉蓯蓉、淫羊藿、蛇床子益腎助陽。

Wnt/β-catenin 信號通路作為最為經典的Wnt 信號通路，參與眾多體細胞的生命活動及進程[11-12]。有研究發現，Wnt/β-catenin 信號通路能夠在腎陽虛的患者體內表達[13]；另有研究發現，成年男性睪丸支持細胞中存在Wnt/β-catenin 信號通路的表達，并且激活Wnt/β-catenin信號通路能夠促進睪丸支持細胞的增殖，從而改善生精功能[6]。本研究表明，具有補腎助陽填精功效的蠶蛾公補合劑能夠顯著改善少弱精子癥患者的精子質量和活力（P＜0.01）；激活少弱精子癥患者睪丸中Wnt/β-catenin 信號通路，通過調控此通路進而改善睪丸生精功能，提升精子質量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突