基于方證對應探討中藥復方分期治療新型冠狀病毒肺炎的網絡藥理學機制

郭 琴，王 穎，王歡歡，柏 冬*

1.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 1007001

2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）爆發以來，引起了全球各界的關注。2020年2月11日國際病毒分類委員會（ICTV）宣布，將新型冠狀病毒正式命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。在治療COVID-19 的過程中，中醫藥的參與度極高，且獲得了確切的療效，COVID-19 在中醫上屬于“疫”的范疇，病位在肺，中醫認為 COVID-19 患者主要由外邪入侵（SARS-CoV-2 感染）和正氣不足（人體免疫力下降）引發，后期由于機體和臟腑功能失調使得疾病進一步加重[1]。中醫強調“扶正”和“祛邪”，注重整體觀和三因制宜，在疫情的防控中發揮著積極的作用。COVID-19 的病情變化具有明顯的階段性，且病情輕重在臨床診療中易于識別，因此分期論治具有合理性和必要性[2]。在國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》第7 版[3]中，中醫采取了分期治療的方式，將疾病的臨床治療期分為輕型、普通型、重型、危重型和恢復期5 個階段。

中醫以整體觀念和辨證論治為治療原則，其中“證”是中醫特有的概念和核心內容，能夠反映疾病發生過程中某一階段病理變化的本質，患者感染SARS-CoV-2 后會因為自身體質、地區和疾病階段而表現為不同的證型，因此利用現代醫學和生命科學等技術和方法，從新的視角深入闡釋中醫證候的形成原因對中醫藥現代化具有重要意義[4]。張伯禮院士團隊[5]結合全國各地病例和治療方案，發現COVID-19的病因多歸為“濕或濕熱之邪”，認為此病當為“濕毒疫”，并將核心病機歸納為“寒、濕、熱、毒、瘀、閉、虛”。基于此，本研究選擇了《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》第7 版[3]中的濕熱蘊肺證（輕型）、濕毒郁肺證（普通型）、氣營兩燔證（重型）、內閉外脫證（危重型）和氣陰兩虛證（恢復期）5 個證型及其對應復方為研究對象，使用網絡藥理學的方法，對5 個證型的證候表現及其所用復方的靶點和通路進行預測和挖掘，以期闡明各證型的分子作用機制。

1 方法

1.1 5 個證型所用復方的活性成分及其靶點的收集

以濕熱蘊肺證（輕型）、濕毒郁肺證（普通型）、氣營兩燔證（重型）、內閉外脫證（危重型）和氣陰兩虛證（恢復期）5 個證型所用復方的中藥為研究對象，使用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中藥綜合數據庫（TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/）和檢索文獻獲得各中藥的主要活性成分，其中TCMSP 數據庫的篩選參數為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug like index，DL）≥0.18。利用TCMSP 數據庫、Swiss Target Prediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）和Pharmmapper數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）獲得各中藥主要活性成分的作用靶點。

1.2 5 個證型臨床表現的靶點收集

對濕熱蘊肺證（輕型）、濕毒郁肺證（普通型）、氣營兩燔證（重型）、內閉外脫證（危重型）和氣陰兩虛證（恢復期）的臨床表現進行整理，使用Geen Card 數據庫（https://www.genecards.org/）、TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）和 OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）檢索各證型臨床表現的靶點。

1.3 蛋白互作（protein-protein interactions，PPI）網絡的構建

對各復方活性成分的靶點和各證型臨床表現的靶點取交集，將各證型的交集靶點上傳至STRING 數據庫（https://string-db.org/），設置生物物種為人，置信度≥0.400，將構建的PPI 網絡信息導入Cytoscape3.8.0 軟件，計算度（degree）值，基于cytoHubba 插件的拓撲算法預測網絡中重要的蛋白節點和子網，并進行可視化處理。

血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是SARS-CoV-2 S 蛋白的受體，介導病毒進入靶細胞。在小鼠急性肺損傷模型中，與野生型小鼠相比，ACE2 基因敲除小鼠的肺功能顯著惡化，而注射外源性重組人ACE2 可減輕肺損傷程度[6]，說明在SARS-CoV-2的致病過程中，ACE2不僅是病毒進入細胞的受體，也是病毒引發肺損傷的靶分子[7]。因此，將ACE2 蛋白與各復方篩選得到的關鍵蛋白共同導入STRING 數據庫構建PPI 網絡，查看復方的關鍵蛋白與ACE2 蛋白的相互作用。

1.4 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將交集靶點導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），選擇生物物種為人，設定閾值為P≤0.05，將富集結果的前20 條通路進行可視化處理。

2 結果

2.1 5 個證型所用復方的活性成分和靶點分析

以OB≥30%、DL≥0.18 為篩選參數，檢索TCMSP 數據庫中COVID-19 的5 個證型復方的主要活性成分和靶點。對于TCMSP 數據庫中不包含的中藥生石膏、水牛角、安宮牛黃丸、麥冬和生地通過TCMID 數據庫檢索其主要活性成分，竹葉（淡竹葉）[8-10]、化橘紅[11-12]、地龍[13]和焦三仙（焦山楂[14-15]、焦神曲[16-19]）通過檢索文獻獲得主要活性成分，并使用Swiss Target Prediction 數據庫獲得其靶點蛋白。生石膏所含成分使用Pharmmapper 數據庫獲得其作用靶點。

忽略炮制方式，5 個證型復方所含中藥的主要活性成分及其作用靶點見表1。其中，濕熱蘊肺證（輕型）復方包含12 種中藥，檢索到188 個活性成分及260 個靶點；濕毒郁肺證（普通型）復方包含13 種中藥，檢索到162 個活性成分及340 個靶點；氣營兩燔證（重型）復方包含12 種中藥，檢索到194 個活性成分及437 個靶點；內閉外脫證（危重型）復方包含4 種中藥，檢索到46 個活性成分及163 個靶點；氣陰兩虛證（恢復期）復方包含10 種中藥，檢索到253 個活性成分及431 個靶點。

表1 COVID-19 的5 個中醫證型復方所含中藥的活性成分和靶點數Table 1 Number of active ingredients and targets of TCM contained in five syndromes related compounds of COVID-19

2.2 5 個證型臨床表現的靶點

將COVID-19 的5 個證型的臨床表現及其對應檢索詞進行整合，利用Geen Card、TTD 和OMIM數據庫檢索各證型臨床表現的靶點，見表2。

2.3 5 個證型及其對應復方的交集靶點

對COVID-19 的5 個證型的臨床表現及其復方的靶點取交集，如圖1所示，5 個證型及其對應復方的交集靶點數目分別是252、322、402、140、399，結果表明5 個證型復方對COVID-19 相關證型具有調控作用。

2.4 PPI 蛋白互作網絡和KEGG 通路分析

將交集靶點上傳至SRTRING 數據庫得到的PPI 網絡導入Cytoscape 3.8.0 軟件，通過CytoHubba插件以度為條件進行拓撲分析，分別篩選出排名前10 的關鍵蛋白，獲得的關鍵蛋白如圖2所示，顏色由紅至黃代表度值從大到小。其中，5 個證型復方的關鍵蛋白都包括血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、蛋白激酶B1（proteinkinase B1，PKB1 或AKT1），說明這4 個靶點在治療COVID-19 的過程中具有重要作用。將5個證型復方的關鍵蛋白與ACE2 蛋白共同導入STRING 數據庫后得到的PPI 網絡如圖3所示，表明5個證型復方的關鍵蛋白與ACE2蛋白關系密切，其中絲裂原激活蛋白激酶 8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、白細胞介素-6（IL-6）和血清白蛋白（albumin，ALB）對ACE2 蛋白有直接作用。

表2 COVID-19 的5 個中醫證型的臨床表現及其靶點數Table 2 Clinical manifestations of five syndromes of COVID-19 and their target number

圖1 COVID-19 的5 個證型及其對應復方的靶點Wenn 圖Fig.1 Target Wenn diagram of five syndromes of COVID-19 and their corresponding compounds

圖2 COVID-19 的5 個證型相關復方的PPI 網絡-通路圖和關鍵蛋白Fig.2 PPI network-pathway diagrams and key proteins of five syndromes related compounds of COVID-19

基于DAVID 數據庫分別對5個證型復方的交集靶點進行KEGG 富集分析，通過Cytoscape 3.8.0 軟件將P（≤0.05）值排名前20的通路與復方的PPI網絡整合，得到5 個復方的PPI 網絡-通路圖，如圖2所示，其中紫色矩形代表交集靶點，紅色矩形代表通路。

圖3 COVID-19 的5 個證型復方的關鍵蛋白與ACE2 蛋白的PPI 網絡Fig.3 PPI network of key proteins of five syndromes related compounds of COVID-19 and ACE2 protein

圖4 COVID-19 的5 個證型復方的通路熱圖Fig.4 Pathways heat map of five syndromes related compounds of COVID-19

分別將COVID-19 的5 個證型復方排名靠前的通路及其P值以熱圖的形式進行整合，見圖4。其中P值由小到大對應顏色由紅色過渡至綠色，可以看出5 個證型復方干預的通路類型大體相似，但各復方干預通路的側重點不同，除內閉外脫證型復方外，其他4 個證型復方都對乙型肝炎（hepatitis B）、腫瘤壞死因子信號通路（tumor necrosis factor signaling pathway）、缺氧誘導因子-1 信號通路（hypoxia inducible factor-l signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease，American trypanosomiasis）、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer）和NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）等通路干預性較強。

3 討論

中醫藥從證候到復方都是在“辨證論治”和“整體觀念”的指導下對疾病進行干預，中藥及其復方具有多成分、多靶點和多途徑的特點，這些特點為中醫藥研究者帶來了挑戰，而網絡藥理學的出現為中醫藥研究提供了新的思路。網絡藥理學基于藥物和疾病間的相互作用，在體外通過計算機虛擬技術構建了“藥物-成分-靶點-通路-疾病”的多層次網絡，具有整體性和系統性的特點[20]，與中醫藥的指導思想趨于一致，眾多研究者將網絡藥理學應用于中醫藥，以解釋中醫藥復雜的作用機制。在治療COVID-19 方面，中醫藥工作者從證型出發，根據患者的不同癥候給予不同的治療方案，而應用網絡藥理學可實現對疾病、證候、中藥及其復方作用機制的挖掘，為COVID-19 的治療提供借鑒和參考。許海玉課題組[21]以“癥狀”為切入點，通過中藥整合藥理學網絡計算平臺2.0，對COVID-19 中4 個時期的代表證候方劑構建了分子網絡，探討了4 個時期COVID-19 的生物學基礎及推薦方劑對證治療的分子機制，對于揭示推薦方劑的作用原理和科學內涵具有重要意義。本研究基于中醫“方證對應”的特點，運用網絡藥理學對COVID-19 發展過程中5 個證型的證候表現及其所用復方的靶點和通路進行預測和挖掘，以期闡述中醫“對證”和“對癥”治療的優勢和特色，解釋中醫分期治療的合理性。

本研究基于網絡藥理學對《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》第7 版的5 個證型及其對應復方進行分析探討，使用數據庫分別篩選出5 個證型臨床表現的靶點及其所用復方主要活性成分的靶點，通過5 個證型的交集靶點構建PPI 互作網絡并獲得關鍵蛋白，其中5 個證型相關復方的關鍵蛋白都包括VEGFA、EGFR、CASP3、AKT1。其中VEGFA是刺激血管生長的主要因子之一，在激活信號通路和誘導內皮細胞增殖和遷移等方面具有重要作用[22]，藥效學實驗表明VEGFA 水平的升高很有可能與肺部炎癥消退有關[23]。EGFR 是非小細胞肺癌中最常見的驅動因子之一，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑是非小細胞肺癌的重要治療手段之一[24]，并且非小細胞肺癌通路也出現在通路富集結果中，說明EGFR 靶點和非小細胞肺癌通路與COVID-19 具有相關性。CASP3 是一種蛋白酶，與細胞凋亡等生理過程中具有重要意義，楊波等[25]研究發現在小鼠感染SARSCoV 導致的心臟損傷和肝臟損傷過程中，CASP3具有顯著調節相關信號通路的作用。AKT1 可通過通路傳導調節細胞代謝、促進細胞生長和增殖等，同時還具有抑制細胞凋亡作用[26]，梁木林等[27]發現p-AKT1 參與了高氧肺損傷的發生發展，其調控機制可能與抑制mTOR 信號通路的活化有關。目前大部分研究表明，ACE2 蛋白是SARS-CoV-2 作用于人體的關鍵蛋白，也是治療COVID-19 的核心靶點[7,28]，本研究將5 個證型相關復方的關鍵蛋白與ACE2 蛋白作PPI 網絡發現，MAPK3、IL6 和ALB 對ACE2蛋白有直接的相互作用，其余關鍵蛋白也可間接作用于ACE2 蛋白，說明5 個證型相關復方可作用于SARS-CoV-2 S 的關鍵蛋白受體（ACE2），從而發揮抗病毒作用。

取交集靶點進行KEGG 通路富集分析，得到每個證型所用復方的基因信號通路，并將排名靠前的通路及其P值以熱圖的形式進行整合，發現除內閉外脫方外，其余4 個復方主要通過干預乙型肝炎、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、恰加斯病、非小細胞肺癌和小細胞肺癌通路等來治療COVID-19，說明4 個證型相關復方在治療其對應證型時具有相同的生理病理基礎，分別是①抗病毒作用：4 個復方主要干預卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎和恰加斯病等與病毒相關的通路。②抑制炎癥反應，增強免疫應答：TNF 可促進T 細胞產生各種炎癥因子，誘導多種細胞內信號通路，包括細胞凋亡和細胞存活以及炎癥和免疫力[29]；HIF-1 是由α 亞基和β 亞基構成的異源二聚體，為細胞適應缺氧的主要轉錄因子和核心調控器，是缺氧應急的關鍵因子，調控細胞的多種缺氧反應，參與多種疾病的生理病理反應，包括癌癥、炎癥和免疫等[30]；③4 個證型相關復方還主要干預非小細胞肺癌和小細胞肺癌2 個與肺部有關的通路，說明其對靶器官（肺）的保護作用。

濕熱蘊肺證（輕型）和濕毒郁肺證（普通型）為COVID-19 的初期，在這個過程中，病毒開始侵入機體，并伴隨發熱、咳嗽、胸悶等癥狀，張鵬葛等[31]總結中醫治療COVID-19 的處方用藥規律發現，初期以化痰止咳平喘、清熱瀉火、發汗解表為主，中藥在這一階段發揮了較大作用，熱圖結果也顯示，這2 個證型相關復方顯著干預的通路較多，廣泛作用于甲型流感和小細胞肺癌等與病毒、流感相關的信號通路，且二者還顯著作用于磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路和叉頭轉錄因子（forkheadboxclass O，FoxO）信號通路等，PI3K-Akt-FoxO 信號通路是調節細胞凋亡的重要途徑。PI3K 催化第2 信使磷脂酰肌醇(3,4,5) 三磷酸等的生成，從而激活磷脂酰肌醇依賴性激酶，后者可使Akt 磷酸化而激活。而FoxO 轉錄因子是PI3K-Akt 信號轉導通路的下游因子之一，當PI3K-Akt 途徑被激活，活化的Akt 會催化FoxO多個位點的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化修飾，從而抑制FoxO 活性，引發PI3K-Akt-FoxO 信號通路的生物學效應[32]，調控機體內的細胞增殖和凋亡過程。

氣營兩燔證和內閉外脫證為COVID-19 的重癥期，此時患者表現為高熱、煩渴、呼吸困難，甚者出現呼吸衰竭、休克、神昏譫語等癥狀，嚴重者器官衰竭，此時中藥復方需和中藥注射劑如血必凈注射液、生脈注射液聯合使用，重癥期患者胸部CT主要表現為雙肺彌漫性實變，其內可見支氣管擴張或空氣支氣管征，雙肺大部分受累時呈“白肺”表現[33]，因此這一階段必要時還需進行呼吸支持和挽救治療，王利等[34]認為COVID-19 患者后期病情加重與細胞因子風暴有關，西醫學對重癥患者的治療雖靶點明確，但作用單一，而中醫藥多靶點、多途徑、多層次，作用廣泛，整體治療優勢突出，在面對細胞因子風暴等復雜疾病的防治中體現出了較高的價值[35]。KEGG 富集結果顯示氣營兩燔證和內閉外脫證相關復方顯著干預的通路雖不及其他3 個證型的復方范圍廣，但二者對神經活性配體-受體相互作用通路的干預較為顯著，說明二者著重緩解神經系統的異常，以恢復機體神志。

氣陰兩虛證是COVID-19 的恢復期，此時患者余邪未盡，但高熱已退，神志恢復，氣陰兩虛證相關復方顯著干預PI3K-Akt 信號通路，該通路有多種下游信號蛋白，可憑借繁多的下游信號蛋白來調節基本的細胞功能，如轉錄、翻譯、增殖、生長、存活和凋亡[36]；該復方還顯著干預類固醇激素的合成、鞘脂信號通路和氮代謝等信號通路。An 等[37]發現與非治療組相比，恢復期服用中藥復方的COVID-19 患者免疫反應（白細胞、淋巴細胞和單核細胞數目顯著減少）、肝功能（γ-谷氨酰轉肽酶明顯降低、前白蛋白明顯改善）和造血凝血功能（血小板、紅細胞和血紅蛋白明顯增加）均有所改善。這說明恢復期中藥復方主要參與細胞生長過程，調控機體的能量代謝和營養物質吸收過程，以增強機體免疫和扶助機體正氣。

綜上所述，5 個COVID-19 的中醫證型相關復方的作用通路具有一定相似性，主要通過抗病毒、抑制炎癥反應、增強免疫應答和保護主要靶器官來治療COVID-19，但各有特點，濕熱蘊肺證和濕毒郁肺證相關復方側重于干擾病毒并增強機體的免疫應答；氣營兩燔證和內閉外脫證相關復方著重緩解神經系統的異常，以恢復機體神志；氣陰兩虛證相關復方進一步參與細胞生長過程和調節機體的能量代謝和吸收過程，以增強機體免疫和扶助正氣，說明了中醫辨證論治和方證對應的治療特點，解釋了中醫分期治療COVID-19 的合理性和科學性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突