逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析及其調節能量代謝和神經遞質機制研究

高 耀，王 鵬，許 騰，武文澤，向 歡，韓雨梅，田俊生*，秦雪梅*

1.山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006

2.山西大學體育學院，山西 太原 030006

逍遙散源于宋代《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當歸、茯苓、白芍、炒白術、炙甘草、薄荷、生姜組成，具有疏肝解郁、養血健脾的功效。在治療抑郁癥方面，逍遙散因其符合整體調節、辨證論治、個體化診療等特點，顯示了獨特的理論優勢和豐富的科學內涵優越性[1-3]。逍遙散能夠通過調節抑郁癥患者和抑郁動物模型機體異常代謝物水平，從而發揮抗抑郁作用[4-22]。課題組前期基于慢性不可預知溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型的內源性代謝物變化探討了抑郁癥的發病機制，從神經遞質、神經營養素、下丘腦-垂體-腎上腺軸、氨基酸、脂質和能量代謝、炎癥因子等方面對逍遙散抗抑郁的作用機制進行分析，歸納總結了逍遙散抗抑郁的代謝網絡調控機制[23-26]。隨著代謝組學技術不斷發展，不同生物樣本的逍遙散抗抑郁作用代謝物數據得到充分的積累。因此，借助“大數據”理念對已有的特征代謝物進行綜合分析，對深入挖掘和闡釋逍遙散抗抑郁的作用機制有重要意義。

本研究從CUMS 動物的血液、尿液、海馬、肝臟、盲腸、糞便和臨床患者的血漿、尿液等生物樣本中逍遙散具有顯著調節作用的差異代謝物進行代謝特征綜合分析，并歸納總結逍遙散在不同生物樣本中調節的關鍵差異代謝物和代謝通路，以期為深入闡釋逍遙散抗抑郁在代謝層次的作用機制提供科學依據。

1 材料

1.1 試劑

血清素（serotonin）購自日本TCI 有限公司；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）購自阿拉丁公司；L-谷氨酸（L-glutamic acid）購自生工生物工程股份有限公司公司；去甲腎上腺素（norepinephrine）購自中國食品藥品檢定研究院；多巴胺（dopamine）、5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid）購自博飛美科公司。

1.2 儀器

1290Ⅱ超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；3200 QTRAP 三重四極桿串聯質譜儀（美國AB Sciex 公司）；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司）；Neofuge 13R 高速冷凍離心機（力康生物醫療科技控股有限公司）。

2 方法

2.1 逍遙散代謝組學的信息收集與歸納分析

采用“抑郁”“抑郁癥”“長期突觸性抑郁”“逍遙”“逍遙散”關鍵詞組合對PubMed、Cochrane Library、Embase、Web of Science、PsycINFO、中國知網、萬方等數據庫進行搜索查詢，時間截止為2020年1月1日。同時通過抑郁癥代謝數據庫進行查詢和補充[27]，通過反復核對，整理逍遙散抗抑郁的代謝組學文獻共19 篇，如表1所示。梳理不同生物樣本在多個不同平臺的代謝組學數據，為后續逍遙散回調差異代謝物的分析和代謝通路的富集提供數據支撐。

表1 逍遙散抗抑郁代謝組學文獻信息Table 1 Information on antidepressant metabonomics of Xiaoyao San

2.2 逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析

逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析是指在逍遙散抗抑郁的代謝組學文獻整理的基礎上，對逍遙散回調差異代謝物和代謝通路進行分析，具體包括差異代謝物數量的比較分析、差異代謝物變化趨勢的統計分析、差異代謝物的驗證分析和差異代謝物的功能分析。其中，差異代謝物變化趨勢的統計分析采用vote-counting 方法確定上調或下調的差異代謝物，并對原始文獻中上調和下調的差異代謝物進行計數[27]。對逍遙散回調差異代謝物進行驗證分析，差異代謝物的功能分析采用Omicsolution 軟件進行代謝物途徑的分析，并篩選符合標準（P＜0.05）的通路。

2.3 逍遙散抗抑郁差異代謝物的驗證分析

采用課題組前期建立的測定大鼠血清中神經遞質水平的方法[28]，通過超高效液相色譜-串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）測定CUMS 大鼠血清樣品。

2.4 統計分析

實驗數據以±s表示，采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，采用Graphpad prism 5 軟件繪圖。

3 結果

3.1 差異代謝物數量的比較分析

如圖1-A 所示，逍遙散對中樞和外周不同生物樣本回調的部分差異代謝物相同。如表2所示，逍遙散回調CUMS 大鼠血液和尿液共有的差異代謝物有4 個，分別是棕櫚酸（palmitic acid）、甘氨酸（glycine）、N-乙酰糖蛋白（N-acetyl glycoprotein）和丙酮酸（pyruvic acid）；逍遙散回調CUMS 大鼠血液和肝臟組織共有的差異代謝物有4 個，分別是L-異亮氨酸（L-isoleucine）、肌酸（creatine）、β-D-葡萄糖（β-D-glucose）、和L-纈氨酸（L-valine）；逍遙散回調CUMS 大鼠尿液和肝臟組織共有的差異代謝物有2 個，分別是檸檬酸（citric acid）和酮戊二酸（oxoglutaric acid）；逍遙散回調CUMS 大鼠海馬和肝組織共有的差異代謝物有1 個，為L-賴氨酸（L-lysine）；逍遙散回調CUMS 大鼠尿液和海馬組織共有的差異代謝物有1 個，為牛磺酸（taurine）；逍遙散回調CUMS 大鼠血液、尿液和肝臟組織共有的差異代謝物有 2 個，分別為L-色氨酸（L-tryptophan）和L-酪氨酸（L-tyrosine）；逍遙散回調CUMS 大鼠血液、海馬組織和肝臟組織共有的差異代謝物有3 個，分別為L-谷氨酸（L-glutamic acid）、L-乳酸（L-lactic acid）和L-谷氨酰胺（L-glutamine）。表明逍遙散可調節動物不同生物樣本的相同差異代謝物發揮抗抑郁作用。

如圖1-B 所示，逍遙散對抑郁癥患者和CUMS動物血液和尿液回調的部分差異代謝物相同。如表2所示，逍遙散對抑郁癥患者和CUMS 動物血液回調的共有差異代謝物有7 個，分別是β-D-葡萄糖、膽堿（choline）、氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide）、L-亮氨酸（L-leucine）、L-乳酸、L-丙氨酸（L-alanine）和甘氨酸；逍遙散對抑郁癥患者和CUMS 動物尿液回調的共有差異代謝物7 個，分別是檸檬酸、L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）、馬尿酸（hippuric acid）、牛磺酸、酮戊二酸、肌酐（creatinine）和L-酪氨酸。逍遙散可能通過分別調節抑郁癥患者和CUMS 動物血漿的7 個差異代謝物和尿液的7 個差異代謝物發揮抗抑郁作用。

圖1 逍遙散回調動物中樞和外周中差異代謝物的韋恩圖 (A) 以及逍遙散回調患者、動物血液和尿液中差異代謝物的韋恩圖 (B)Fig.1 Venn diagram of Xiaoyao San callback differential metabolites in central and peripheral of animals (A),Venn diagram of Xiaoyao San callback differential metabolites of blood and urine in patients and animals (B)

表2 逍遙散回調共有差異代謝物信息Table 2 Information of Xiaoyao San callback shared differential metabolites

3.2 差異代謝物變化趨勢的統計分析

通過對逍遙散回調差異代謝物進行分析，發現在不同生物樣本中，逍遙散調節相同的差異代謝物。進一步對回調差異代謝物進行統計，發現逍遙散調節34 個相同差異代謝物，如圖2所示，差異代謝物按頻數排序依次為乳酸（頻數＝7）、谷氨酸（頻數＝7）、丙氨酸（頻數＝6）、檸檬酸（頻數＝6）、酪氨酸（頻數＝6）、苯丙氨酸（頻數＝5）、膽堿（頻數＝5）、氧化三甲胺（頻數＝5）、谷氨酰胺（頻數＝5）、棕櫚酸（頻數＝5）。

圖2 逍遙散回調差異代謝物的矩陣氣泡圖Fig.2 Matrix bubble diagram of Xiaoyao San callback different metabolites

乳酸是報道次數最多的逍遙散回調差異代謝物，動物ip 乳酸鈉（2 μg/kg）后，動物活動異常且活動減少[29]。乳酸鈉可以急劇增加血液中的乳酸，同時增加大腦中的細胞外葡萄糖，葡萄糖是重要的能量代謝供應物質，逍遙散對CUMS 模型大鼠的能量代謝異常均有明顯的治療效果[30]。由此可見，這些調節的差異代謝物在逍遙散抗抑郁作用中發揮重要作用，可以為逍遙散抗抑郁療效標志物的篩選和驗證提供依據。

由于樣本來源、備樣方法、測試條件和數據采集等不同，不同類型的差異代謝物的變化趨勢也不完全相同。進一步對不同差異代謝物的趨勢進行分析，發現在34 個差異代謝物中，有11 個差異代謝物的變化趨勢一致。如圖3-A 所示，逍遙散上調的差異代謝物有7 個，分別為L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸（L-proline）、L-異亮氨酸、吲哚乙酸（indoleacetic acid）和酮戊二酸；逍遙散下調的差異代謝物有4 個，分別為β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖（α-D-glucose）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）和D-果糖（D-fructose）。其中，酮戊二酸和果糖為變化趨勢一致且報道次數最多的差異代謝物。此外，在34 個差異代謝物中，有23個差異代謝物的變化不完全一致，如圖3-B 所示，逍遙散在不同生物樣本中差異代謝物（下調數＞上調數）有10 個，分別為L-乳酸、L-丙氨酸、D-葡萄糖、甘氨酸、肌酸（creatine）、L-谷氨酰胺、膽堿、牛磺酸、馬尿酸和N-乙酰糖蛋白；逍遙散在不同生物樣本中差異代謝物（下調數＝上調數）有5 個，分別為L-酪氨酸、檸檬酸、L-絲氨酸（L-serine）、草酸（oxalic acid）和3-羥基丁酸（3-hydroxybutyric acid）；逍遙散在不同生物樣本中差異代謝物（下調數＜上調數）有8 個，分別為L-苯丙氨酸和琥珀酸（succinic acid）、丙酮酸、L-色氨酸和肌酐、L-谷氨酸、棕櫚酸和氧化三甲胺。

圖3 逍遙散回調差異代謝物的變化趨勢Fig.3 Histogram of Xiaoyao San callback different metabolites

3.3 差異代謝物的驗證分析

如圖4所示，CUMS 造模28 d 后，與對照組比較，模型組大鼠血清中血清素、去甲腎上腺素和γ-氨基丁酸水平顯著降低（P＜0.001），5-羥基吲哚乙酸和L-谷氨酸水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，逍遙散組大鼠血清中血清素、去甲腎上腺素和γ-氨基丁酸水平顯著升高（P＜0.01、0.001），5-羥基吲哚乙酸和L-谷氨酸水平顯著降低（P＜0.001）。表明逍遙散能夠逆轉CUMS 引起的大鼠神經遞質的變化。

3.4 差異代謝物的功能分析

通過對差異代謝物通路進行分析，發現逍遙散調節通路有47 條，如圖5所示，分為能量代謝、神經系統、氨基酸代謝、其他氨基酸代謝、物質依賴性、輔助因子和維生素代謝、內分泌系統、消化系統等通路。其中能量代謝包含的通路有檸檬酸循環、丙酸代謝、半乳糖代謝、抗壞血酸和醛酸鹽代謝、戊糖磷酸途徑、硫代謝和氮代謝；神經系統包含的通路有逆行內源性大麻素信號、突觸小泡周期、谷氨酸能突觸、長期抑郁和膽堿能突觸。

4 討論

圖4 逍遙散對CUMS 大鼠血清中去甲腎上腺素 (A)、血清素 (B)、5-羥基吲哚乙酸 (C)、多巴胺 (D)、L-谷氨酸 (E) 和γ-氨基丁酸 (F) 水平的影響 (x s,n=8)Fig.4 Effect of Xiaoyao San on levels of norepinephrine (A),serotonin (B),5-hydroxyindoleacetic acid (C),dopamine (D),L-glutamic acid (E),and γ-aminobutyric acid (F) in serum of CUMS rats (x s,n=8)

圖5 逍遙散富集通路類點圖Fig.5 Dot plot diagram of Xiaoyao San enrichment pathway category

本研究對動物的血液、尿液、海馬、肝臟、盲腸、糞便和臨床患者的血漿、尿液等生物樣本中逍遙散具有顯著調節作用的差異代謝物進行代謝特征綜合分析，發現檸檬酸循環是逍遙散抗抑郁的重要通路之一。能量代謝障礙是抑郁癥病因之一，研究發現，脾虛及能量代謝障礙是抑郁癥發病的關鍵病機[31]；線粒體能量代謝障礙在抑郁癥發病機制中發揮關鍵作用[32]。課題組前期研究發現逍遙散能夠治療抑郁癥核心癥狀即情緒低落，還能明顯改善患者疲勞癥狀[33]；逍遙散中多個成分可通過鈉鉀ATP酶α1 及ATP 合酶α、β、γ 亞基等靶點，調節三羧酸循環通路，從而發揮抗抑郁作用[34]。逍遙散能夠減少抑郁癥患者或CUMS 模型動物耗能，調節三羧酸循環功能，從而全面使機體的能量代謝趨于正常狀態。

神經遞質通路是研發抗抑郁藥物的重要通路。CUMS 抑郁模型動物中海馬組織中血清素水平顯著降低，以逍遙散干預后，血清素水平顯著升高[35]。逍遙散低極性分離組分對大鼠腦突觸體攝取血清素有明顯抑制作用[36]。去甲腎上腺素水平在CUMS抑郁大鼠腦組織和體液中顯著降低，逍遙散能夠顯著升高CUMS 抑郁大鼠腦組織和體液中去甲腎上腺素水平[35,37]，表明逍遙散可能通過抑制腦突觸體對去甲腎上腺素的重攝取發揮抗抑郁作用。CUMS抑郁模型大鼠腦中谷氨酸水平顯著升高，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體表達水平顯著降低，NMDA 受體的過度激活，導致Ca2＋內流引起神經元凋亡；以逍遙散進行干預后，NMDA 受體表達水平恢復至正常水平[38-39]。結果表明逍遙散可以通過調節神經遞質通路發揮抗抑郁作用。

目前許多研究中無法獲得原始數據代謝數據集或平均代謝物濃度[40]，本研究采用vote-counting方法對逍遙散調節差異代謝物進行梳理[41-42]。傳統的代謝組學關注少量的差異代謝物，而抑郁癥是病因復雜的精神系統疾病，生物學功能的整合分析尤為重要，能夠通過整合來自多個來源的數據在同一個生物背景下進行系統性分析，闡明逍遙散治療抑郁癥的機制[43-44]。因此，本研究采用多個差異代謝物相關的數據進行富集。

逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析為逍遙散后續實驗的設計提供系統分析，一些重要的差異代謝物及富集的代謝通路為深入研究逍遙散抗抑郁提供了方向。課題組后續將對本研究中發現的差異代謝物和代謝通路進行驗證，包括靶標代謝組學驗證，即以標準品為參照，對特定的差異代謝物群進行有針對性地、特異性地檢測與定量分析；示蹤代謝組學驗證，即以13C 或15N 等原子標記的穩定同位素示蹤輔助代謝組學技術研究抑郁癥的特有代謝通路以及逍遙散的回調機制[45-46]；功能代謝組學驗證，采用分子生物學包括基因沉默或基因過表達等技術驗證關鍵靶點[47-48]。抑郁癥的生物學過程不僅僅通過代謝水平變化闡明[49]。因此，課題組后續將整合蛋白質組學和轉錄組學數據，進行多組學技術的關聯分析，通過生物網絡與網絡藥理技術，采用網絡拓撲屬性和模塊分析差異代謝物相關的一系列重要的“成分-靶點-代謝物-生物途徑”，闡明逍遙散與抑郁癥多成分、多靶點的科學內涵。

綜上所述，本研究發現能量代謝和神經遞質通路是逍遙散發揮抗抑郁作用的主要通路，為系統挖掘逍遙散抗抑郁代謝機制提供依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突