基于液質聯用和核磁共振的龍葵莖化學成分研究

高淑紅，蘇珍枝，楊琳嬌，李震宇*

1.山西藥科職業學院，山西 太原 030031

2.山西大學中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006

龍葵為茄科植物龍葵Solanum nigrumL.的干燥全草，別名苦葵、水茄、老鴉酸漿草等[1]。性寒，味苦、微甘，歸肺、胃、膀胱經，具清熱解毒、活血散瘀、利水消腫、止咳祛痰之功效，臨床廣泛用于抗炎、抗休克、抗病毒及抗腫瘤等方面[2]。

近年來對龍葵的化學成分進行了大量研究，顯示龍葵全草中含有多種甾體生物堿，其中以澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量最高[3]；此外，從龍葵全草分離得到了以薯蕷皂苷元和替告皂苷元為母核的甾體皂苷化合物，以及黃酮類化合物、小分子有機酸類等化合物[4-5]。另有針對龍葵果、龍葵葉等進行化學成分研究，顯示龍葵果中含有生物堿、氨基酸、色素等化學成分[6]，葉中含有生物堿、甾體皂苷類化合物等[7-8]。龍葵的藥用部位是全草，通過本課題組的調查分析，全草中包括龍葵莖、葉、果，其中以莖為主，占到龍葵藥材質量的60%以上。但目前化學研究未見對莖化學成分的單獨報道。鑒于莖在龍葵藥材中占有較大比重，有必要對其化學成分進行系統分析。

近年來液質聯用技術在中藥化學成分快速識別中得到了廣泛的應用，如有研究采用UPLC-QTOF-MS 技術從刺梨籽中鑒定55 個化學成分[9]；運用UHPLC-Q-Orbitrap MS 技術從紅花中鑒定出135個次生代謝物[10]。核磁共振氫譜（1H-NMR）具有重現性好、分析時間短、備樣方法簡單、可以檢測大部分含氫化合物等優勢，尤其適用于檢測色譜柱上不保留的強極性化合物，與液質聯用分析具有互補性。因此本實驗擬采用UHPLC-Q Exactive 高分辨質譜與核磁共振氫譜（1H-NMR）結合對龍葵莖的化學成分進行快速識別。

1 儀器與試劑

Thermo fisher U3000 超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器（美國賽默飛世爾科技公司），ThermoScientificTMQ Exactive 組合型四極桿Orbitrap 質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Bruker 600 MHz Avance III NMR波譜儀（德國布魯克公司），十萬分之一天平（梅特勒?托利多儀器有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器，XK-80A 快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司）。

龍葵2019年8月采集于山西省五臺縣蔣坊鄉，由山西藥科職業學院劉林鳳教授鑒定為茄科茄屬植物龍葵S.nigrumL.的全草。NMR 試劑重水（Norell，Landisville，美國）、氘代甲醇（99.8%，Merck，德國）、氘代三甲基硅烷丙酸鈉鹽（TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc，MA，美國），甲醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠），甲酸、乙腈（質譜純，美國Thermo 公司），超純水由Milli-Q 純凈水系統（美國Millipore 公司）制備。對照品澳洲茄胺（批號19121-58-5，質量分數≥94.5%）、澳洲茄堿（批號20318-30-3，質量分數≥95%）均購于上海安奈德化學技術中心；綠原酸（批號YJ-141004，質量分數≥98%）購自江蘇永健醫藥有限公司。

2 方法

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～15 min，5%～20% B；15～20 min，20%～35%B；20～30 min，35%～55% B）。柱溫為35 ℃，體積流量為0.25 mL/min，進樣量為1 μL。

2.1.2 質譜條件 Full MS/DD MS2（TOPN）：采用電噴霧離子源（HESI）；掃描方式采用正負離子同時掃描；毛細管溫度為320 ℃；鞘氣體積流量為241.5 kPa（35 psi），輔助氣體積流量為69 kPa（10 psi）；正離子模式下噴霧電壓為3.5 kV，負離子模式下噴霧電壓為2.5 kV，透鏡電壓為55 kPa；探頭加溫器溫度為300 ℃；最大噴霧電流為100 V；NEC：20，40，60；掃描質量范圍為m/z80～1200，質量分辨率為70 000。

2.2 核磁測定條件

樣品于600 MHz（25 ℃）NMR 儀（Bruker，Germany）上測定，采樣次數為64，譜寬12345.7 Hz，脈沖時間14 μs，采樣時間2.654 s，弛豫時間1.0 s，采樣數據點65 536，FID 分辨率0.188 Hz，采樣間隔40.5 μs，手動進行相位調節、基線調節及峰校正。提取物核磁測定采用noesygppr1d 序列壓制水峰，內標為TSP。

2.3 供試品溶液的制備

取中等寬度的龍葵莖適量，粉碎，過80 目篩，精密稱取粉末0.50 g，置于10 mL 玻璃管中，加50%甲醇水溶液6 mL，渦旋1 min，超聲提取25 min，放冷至室溫，3500 r/min 離心25 min，取上清液經0.22 μm 微孔濾膜濾過，用于UPLC-Q Exactive MS分析。

精密稱取液氮研磨后的藥材粉末0.50 g，過80目篩，置于10 mL 離心管中，加蒸餾水及甲醇各3 mL，渦旋混勻1 min，超聲提取25 min，室溫下3500 r/min 離心25 min，提取液減壓濃縮蒸干。測定前加入氘代甲醇300 μL 與氘代重水300 μL，復溶后轉移至1.5 mL 離心管中，13 000 r/min 離心10 min，移取上清液500 μL于5 mm核磁管中，用于1H-NMR分析。

2.4 對照品溶液制備

稱取澳洲茄胺和澳洲茄堿對照品適量，精密稱定，轉置于5 mL 量瓶中用甲醇溶解，定容，分別配制質量濃度為2.040、2.030 mg/mL 的母液，取適量母液，稀釋10 倍置于4 ℃冰箱，備用。

2.5 化合物結構分析

采用Xcalibur3.2軟件對采集到的原始質譜數據進行峰提取、峰匹配分析處理。采集到的原始數據導入Compound Discover 3.0 軟件中，保留時間設置在0～33 min，m/z80～1200，偏差為5×10?6，信噪比為3，保留時間偏移值為0.1 min；通過峰提取、搜索在線及本地數據庫、化合物預測等數據處理，導出樣品名稱、保留時間、分子式、質荷比以及對應的離子強度組成的數據集。核磁圖譜采用MestReNova（Version，8.0.1，Mestrelab Research，Santiago de Compostella，西班牙）軟件進行處理。

3 結果

3.1 采用UHPLC-Q Exactive MS 表征龍葵莖中的化學成分

采用Xcalibur3.2 數據軟件進行分析處理，正、負模式下的總離子流圖見圖1，各峰獲得良好分離，從龍葵莖中共鑒定出68 個化合物（表1），包括生物堿5 個，皂苷28 個，游離氨基酸9 個，咖啡酰基奎尼酸類、脂肪酸類以及核苷類等其他化合物26 個。

圖1 龍葵莖正 (A)、負 (B) 離子模式下總離子流圖Fig.1 Base peak ion chromatogram of stems of S.nigrum in positive mode (A) and negative mode (B)

3.1.1 生物堿類 根據文獻報道[2]，龍葵中的生物堿主要為膽甾烷類生物堿，代表性成分主要為澳洲茄胺、澳洲茄堿和次勒帕茄堿I（leptinine I）。在正離子模式下，化合物32 的保留時間為17.87 min，準分子離子峰為m/z884.499 5 [M＋H]+，在二級質譜中失去1 個Rha 得到m/z738.429 9 [M＋H－Rha]＋，進一步失去2 個Hex 得到m/z414.336 8 [M＋H?Rha?2Hex]＋，再進一步失去1 分子水和C8H15N，得到m/z271.204 8 [M＋H－Rha－2Hex－H2OC8H15N]+，最后失去1 分子H2O 得到m/z253.195 1[M＋H－Rha－2Hex－H2O－C8H15N－H2O]+，與文獻報道的二級碎片一致[17]，進一步通過對照品對照，鑒定化合物32 為澳洲茄堿。澳洲茄堿的裂解途徑見圖2。

在正離子模式下，化合物40 的保留時間為18.51 min，準分子離子峰為m/z868.505 3 [M＋H]＋，在二級質譜失去1 分子H2O 得到m/z850.494 6 [M＋H－H2O]+，再失去1 個Rha 得到m/z704.441 9 [M＋H－H2O－Rha]＋，進一步失去1 個Rha 和Hex 得到m/z396.326 2 [M＋H－H2O－Rha－Hex－Rha]+，再進一步失去C8H15N，得到m/z271.204 8 [M＋HH2O－Rha－Hex－Rha－C8H15N]+，最后失去1 分子H2O 得到m/z253.195 1 [M＋H－H2O－Rha－Hex－Rha－C8H15N－H2O]+，與文獻中次勒帕茄堿I 數據一致[18]。采用類似方法，從龍葵莖提取物中共鑒定膽甾烷類生物堿5 個，除澳洲茄堿和次勒帕茄堿I，還包括γ-澳洲茄邊堿及其異構體、β1-澳洲茄堿。

結合文獻報道[19]分析膽甾烷類生物堿二級質譜裂解規律：首先在ESI 源的轟擊下生成正離子，失去糖鏈生成母核離子澳洲茄胺或茄次堿，進一步失去1 分子水與C8H15N，最后再失去1 分子水。因此，龍葵中膽甾烷類生物堿特征離子有m/z414.33（C27H44NO2+）、396.32（C27H42NO+）、271.20（C19H27O+）、253.19（C19H25+），中性碎片有m/z162.05（Hex）、146.05（Rha）等。

表1 龍葵中鑒定化學成分的質譜數據Table 1 MS results of constituents identified in S.nigrum

續表1

龍葵中膽甾烷類生物堿母核主要為澳洲茄胺（C27H43NO2）、雙鍵被還原的澳洲茄胺（C27H45NO2），以及澳洲茄胺 C-27 位甲基被氧化成羧基（C27H41NO4）[20]，主要衍生化方式有鼠李糖基化、己糖基化（葡萄糖基化、半乳糖基化）、木糖基化等。根據龍葵中已經報道的膽甾烷類生物堿的結構變化規律，使用Cytoscape 對其分子式進行關聯分析，建立膽甾烷類生物堿分子網絡（圖3）。菱形代表文獻中已報道過的化合物[20-22]，橢圓形代表根據結構特征預測的可能結構。該分子網絡圖包括31 個膽甾烷類生物堿分子式，其中文獻已報道的12 個，預測的19 個。將構建的膽甾烷類生物堿進行母離子提取，并在二級質譜圖中尋找二級離子碎片，根據上述分析確定的質譜特征碎片，除了上述已經鑒定的5 個生物堿，未篩查到其余生物堿的特征質譜信號。在分子網絡圖中，藍色代表在本研究中鑒定到的化合物，粉色代表未鑒定到的化合物。

續表1

圖2 澳洲茄堿的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of solasonine

圖3 龍葵莖中生物堿 (A) 和甾體皂苷 (B) 的分子網絡Fig.3 Structural network of alkaloids (A) and steroidal saponins (B) from stems of S.nigrum

3.1.2 甾體皂苷類 龍葵中另一類重要的次級代謝產物為甾體皂苷類[4]。在正離子模式下，化合物54 的保留時間為21.43 min，準分子離子峰為m/z415.321 0 [M＋H]+，母離子脫去1 分子水得到m/z397.310 3 [M＋H－H2O]+，失去C8H16O2得到m/z271.205 6 [M＋H－H2O－C8H16O2]+，進一步失去1 分子水得到m/z253.195 1 [M＋H－H2O－C8H16O2－H2O]+，與薯蕷皂苷元數據一致[16]。

化合物44：保留時間為18.69 min，在正離子模式下，準分子離子峰為m/z1 035.537 1 [M＋H]+，在二級質譜中失去1 分子Hex 得到m/z873.447 4[M＋H－Hex]+，再失去1 分子Xyl 得到m/z741.442 2[M＋H－Hex－Xyl]+，進一步失去Hex 得到m/z579.390 0 [M＋H－Hex－Xyl－Hex]+，再失去1 分子Hex 得到m/z417.336 3 [M＋H－Hex－Xyl－Hex－Hex]+，最后失去C8H16O2得到m/z273.221 4 [M＋H－Hex－Xyl－Hex－Hex－C8H16O2]+，與文獻中去半乳糖替告皂苷數據一致[7]。它的裂解途徑見圖4。

圖4 去半乳糖替告皂苷的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathways of degalactotigon

圖5 龍葵中皂苷元的結構Fig.5 Structures of saponin aglycone of S.nigrum

通過分析該類化合物的結構特點及文獻報道[16]的二級質譜碎片，龍葵中不同皂苷元類型（圖5）的甾體皂苷類化合物存在一定裂解規律：（1）首先失去糖基等中性片段，生成母核離子；（2）母核離子發生異構化或者失去1 分子H2O；（3）異構化的母核離子先失去C8H16O2中性碎片，并脫掉1 分子H2O；（4）母核離子脫掉1 分子H2O 后進一步失去C8H16O2中性碎片。因此，該類皂苷化合物共有的中性丟失碎片有 Hex（m/z162.05）、Rha（m/z146.05）、Xyl（m/z132.05）；不同母核的甾體皂苷類化合物有不同的特征離子，薯蕷皂苷元（diosgenin，D）為母核的化合物的特征離子包括m/z397.32（C27H41O2+）、271.22（C19H27O+）、253.21（C19H25+）等；替告皂苷元（tigogenin，T）為母核的特征離子包括m/z417.33（C27H45O3+）、399.32（C27H43O2+）、273.22（C19H29O+）、255.21（C19H27+）；羥基化薯蕷皂苷元（hydroxydiosgenin，HD）[23]為母核的化合物的特征離子包括m/z415.33（C27H43O3+）、397.32（C27H41O2+）、271.22（C19H27O+）、253.21（C19H25+）等。

龍葵中皂苷類化合物主要的苷元結構如圖5所示，連接的糖基主要有己糖基（葡萄糖及半乳糖）、鼠李糖基以及木糖基。根據這3 種皂苷元的結構，以及不同的糖鏈連接方式，使用Cytoscape 進行關聯分析，建立皂苷結構分子網絡（圖3-B）。橢圓形代表文獻中報道過的皂苷化合物分子式，六邊形代表根據結構特征所預測的潛在皂苷類分子式。該分子網絡包括32 個皂苷類分子式，其中文獻已報道的皂苷分子式有9 個，預測的皂苷分子式23 個[17-19]。根據上述皂苷質譜特征，對網絡圖中的皂苷化合物進行篩查。在正離子模式下共鑒定出17 個皂苷類化合物，其中以薯蕷皂苷元為母核的有1 個化合物，包括D?Hex?Hex（C39H62O13）；替告皂苷元為母核的化合物有15 個，包括T?Hex（C33H54O8）及其異構體，T?Hex?Hex（C39H64O13）及其異構體，T?Hex?Hex?Hex（C45H74O18）、T?Hex?Hex?Rha（C45H74O17）、T?Hex?Hex?Xyl?Hex?Hex（C56H92O27）等；以及HD 苷元，即hydroxydiosgenin（C27H42O4）。圖3-B 中綠色代表在龍葵莖中鑒定的皂苷類化合物，粉色代表未鑒定，即在龍葵莖中排除的皂苷類化合物。

3.1.3 咖啡酰奎尼酸類 綠原酸為常見的咖啡酰奎尼酸類化合物，其分子式為C16H18O9。在負離子模式下，化合物22 的準分子離子峰為m/z353.087 8[M－H]?，保留時間為2.41 min，準分子離子峰酯鍵斷裂失去C9H7O3，得到m/z191.056 0 [M－C9H7O3－H]?，進一步失去1 分子H2O 得到m/z173.048 8 [MC9H7O3－H2O－H]?，另外還有脫掉奎尼酸產生的m/z179.035 4 [M－C7H11O5－H]?碎片峰，推測化合物22 為綠原酸[12]。化合物15 在正離子模式下產生準分子離子峰m/z355.102 3 [M＋H]+，保留時間為1.50 min，二級質譜離子包括：準分子離子峰失去C9H7O3，得到m/z192.039 4 [M－C9H7O3＋H]+，進一步失去H2O 得到m/z177.016 2 [M－C9H7O3－H2O＋H]?，推測化合物15 可能是綠原酸的單咖啡酰奎尼酸異構體[24]。

3.1.4 氨基酸類 龍葵莖中還鑒定到氨基酸類化合物。如化合物1 在正離子模式下產生準分子離子峰m/z175.119 8 [M＋H]+，二級碎片有m/z116.170 9[M－CH4N3＋H]+、m/z71.069 0 [M－COOHCH4N3＋H]+、m/z70.065 8 [M－CO2－H2OCH4N3＋H]+、m/z60.056 3 [M－NH3－COOHC4H5＋H]+，通過文獻對照[24]確定為精氨酸。龍葵莖中鑒定的其他氨基酸還包括纈氨酸、焦谷氨酸、色氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。

3.1.5 脂肪酸類 龍葵中鑒定到2 種脂肪酸，分別為亞麻酸和棕櫚酸。化合物61 在正離子模式下，保留時間為28.09 min，準分子離子峰為m/z257.247 2[M＋H]+，二級碎片含有m/z239.178 9 [M－H2O＋H]+、m/z199.148 2 [M－C4H9＋H]+、m/z155.085 3[M－COOH－C4H8＋H]+、m/z117.070 5 [M－COOHC10H9＋H]+，鑒定為棕櫚酸[11]。

3.1.6 核苷類 文獻報道龍葵中含有少量的核苷類化合物[5]，本研究在正離子模式下共鑒定出5 個核苷類化合物，主要包括腺苷、尿苷、腺嘌呤和次黃嘌呤等。以化合物56 為例，在正離子模式下，保留時間為22.39 min，準分子離子峰為m/z268.104 2[M＋H]+，失去1 分子C5H8O4得到m/z136.062 5[M＋H－C5H8O4]+，然后失去1 分子NH3得到m/z119.049 4 [M＋H－C5H8O4－NH3]+，參照文獻報道[11]鑒定其為腺苷。

3.1.7 Compound Discover 3.0 鑒定 將樣品和空白溶劑的譜圖導入Compound Discover 3.0 軟件，設置預測化合物的分子組成為C、H、O、N，將化合物碎片匹配值設置在50%以上，通過CD 數據庫進行自動結構指認，導出345 個可能的化合物，手動去除非天然產物、未提取到準分子離子峰的化合物、匹配度低于70%的化合物且沒有二級質譜圖的化合物，經過二級質譜碎片信息核對，共指認14 個化合物，其中包括上述鑒定的化合物12 個，新鑒定化合物2 個，包括吲哚-3-丙烯酸和6-羥基木犀草素-7-槐糖苷。

3.2 1H-NMR 結果與分析

通過與文獻報道、BMRB 數據庫中的標準物質圖譜對照，并對1H-NMR 圖進行分析（圖6），共指認出27 個化合物（表2）。1H-NMR 圖譜可以分為3個區域：高場區（δ0.00～3.56）主要包括有機酸、氨基酸，如乳酸δ1.35 (d,J=6.0 Hz)、丙氨酸δ1.48(d,J=7.2 Hz)，異亮氨酸δ1.02 (d,J=6.6 Hz)、δ0.94(t,J=7.2 Hz)，亮氨酸δ0.96 (d,J=6.0 Hz)、δ0.98(d,J=6.0 Hz) 等；碳水化合物區 (δ3.56～5.50) 主要為糖基，包括α-葡萄糖基δ5.21 (d,J=3.6 Hz)、β-葡萄糖基δ4.59 (d,J=7.8 Hz)、蔗糖基δ5.41 (d,J=4.2 Hz)；低場區 (δ5.50～9.16) 指認的化合物主要含氮或芳香類化合物，如葫蘆巴堿δ9.16 (s),8.10 (t,J=6.6 Hz),8.87 (t,J=8.4 Hz)，尿嘧啶δ5.75 (d,J=7.8 Hz),7.52 (d,J=7.8 Hz)，尿苷δ5.85 (d,J=4.2 Hz),5.91 (d,J=4.8 Hz),7.93 (d,J=8.4 Hz) 等。通過核磁共振鑒定的27 個化合物中，有6 個化合物（精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、尿苷和腺苷）已在質譜中鑒定，另外21 個化合物僅在核磁分析中鑒定。

4 討論

本研究采用高分辨液質聯用技術結合代謝組學技術對龍葵莖進行了化學成分分析。從龍葵莖中共鑒定到化合物89 個，包括甾體生物堿5 個、甾體皂苷28 個、游離氨基酸16 個、咖啡酰基奎尼酸類、脂肪酸類以及核苷類等其他化合物40 個。其中，有54 個化合物在龍葵中首次報道。

甾體生物堿和甾體皂苷是龍葵的特征成分，通過分析已報道的甾體生物堿和甾體皂苷結構變化規律，本研究分別構建了這兩類成分的分子網絡，并預測了龍葵莖中可能存在的甾體生物堿和甾體皂苷。通過對預測化合物的質譜篩查和碎片特征分析，雖然未檢測到新的生物堿，但篩查到新的甾體皂苷分子式6 個，由于皂苷糖鏈可有多種連接方式，這些皂苷分子式對應潛在的皂苷類化合物16 個。這些皂苷類可能都是未見文獻報道的新化合物，但需要進一步通過植物化學分離鑒定手段進行驗證。

圖6 龍葵莖提取物的1H-NMR 圖譜Fig.6 1H-NMR spectra of extracts from stems of S.nigrum

表2 龍葵中鑒定化合物1H-NMR 數據歸屬Table 2 1H-NMR assignments of identified compounds from stems of S.nigrum

此外，本研究使用的核磁共振分析是一種非選擇性檢測技術，不受液質分析中化合物是否容易離子化和在色譜柱上保留強弱的影響。因此，在中藥復雜體系鑒定中，核磁共振與液質聯用分析具有互補性。本研究通過核磁圖譜分析，進一步鑒定了龍葵莖中27 個化合物，不僅驗證了已經在質譜中鑒定的6 個化合物，而且還鑒定21 個未在質譜中鑒定的化合物。核磁共振與液質聯用的整合分析，進一步豐富了我們對龍葵莖的化學認識。甾體生物堿是龍葵的特征成分，然而本研究僅在莖中檢測到生物堿5 個，說明莖中生物堿的多樣性明顯低于龍葵果。鑒于龍葵莖在龍葵藥材中占有較大的比重，今后的研究還應對龍葵莖的生物活性進一步分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突