Box-Behnken法冷鮮灘羊肉蛋白質的高光譜模型優化

樊奈昀，劉貴珊，張晶晶，張 翀，袁瑞瑞，班晶晶

寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021

引 言

高光譜成像技術可以提供與樣品物理和化學特性相關的空間和光譜信息，在食品、農業、化工，制藥等領域中得到了廣泛的應用[1-2]。光譜信息與待測成分間模型的建立非常關鍵，直接影響光譜分析的工作效率和質量[3-4]。以往有關建模條件的研究只考慮某一方面的優化，存在方法組合考察不全面的問題。因此，為了提高模型的魯棒性，需要對波段選擇、預處理和建模方法的組合進行綜合考察。響應面設計可以對建模過程中的影響因子和水平及其交互作用進行優化和評價，是一種采用多元二次回歸方程以及多種統計方法分析尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法[5]。目前有關高光譜成像技術結合化學計量學方法和響應面試驗設計在高光譜檢測中的研究鮮有報道。

綜上，針對建模因素之間存在相互作用的影響情況，以冷鮮灘羊肉的蛋白質含量檢測為例，采用響應面試驗設計思路，綜合考察不同特征優選、預處理及多元校正方法對光譜定量分析模型的作用，建立冷鮮灘羊肉蛋白質含量的分析優化檢測體系，為冷鮮肉從生產到銷售的數字精細化技術開發應用提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 樣本采集

90只灘羊樣本[4～6月齡，平均胴體重(32.8±4.02) kg]，寧夏鹽池大夏牧場食品有限公司。屠宰后，取其背最長肌，置于0～4 ℃的便攜式冰箱運往實驗室。4 ℃條件下排酸處理24 h，排酸完成后取出羊肉，除去其脂肪和肌膜，切成(3.0 cm×2.0 cm×1.0 cm)塊狀樣本。通過Kennard-Stone(KS)方法選取67個樣本作為校正集，其余23個樣本作為驗證集。

1.2 高光譜圖像的采集

可見/近紅外高光譜成像系統(400～1 000 nm，125個波段)，主要由五部分組成： V10E-QE型高光譜成像光譜儀(芬蘭Spectral Imaging Ltd公司)； C8484-05G型CCD相機(日本Hamamatsu公司)； DCR Ⅲ型光纖鹵素燈150 W(美國Schott公司)； SC300-1A型電控位移平臺(北京Zolix公司)； 計算機(北京 Zolix公司)。

啟動高光譜系統預熱30 min后，通過黑白校正來減少攝像頭光源不均勻、光敏單元本身響應錯亂，暗電流及偏置等因素對圖像的影響[6]。

1.3 理化指標測定

根據GB-5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定冷鮮灘羊肉背最長肌中蛋白質含量。

1.4 Box-Behnken優化試驗

為綜合考察不同特征優選方法、預處理方法及多元校正方法對蛋白質可見/近紅外光譜模型定量分析的影響，以特征優選(A)、預處理(B)、多元校正(C)為考察因素，目標函數F為響應值評價指標，如式(1)所示。根據Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken法設計響應面試驗方案，確定蛋白質含量的最佳光譜檢測體系，試驗因素與水平設計見表1。

(1)表1 試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels code

2 結果與討論

2.1 一維光譜特征

圖1為原始平均光譜圖，在400～570 nm波段范圍內，肉樣光譜反射率較低，在610～780 nm波段范圍內，肉樣在橙紅色區域反射率較強，波譜吸收取決于物質分子基團的電子能級躍遷，不同物質具有特定的吸收帶。在可見光區域，觀察到肉樣在430，540，575，758和971 nm波谷處有主要吸收帶，430 nm處的吸收帶與肉樣中血紅蛋白化學鍵振動有關，540和575 nm處的吸收帶與脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白有關，758和971 nm處的吸收帶由肉樣水分中O—H基團的三倍和二倍頻特征吸收所引起[7-8]。

圖1 平均原始光譜曲線Fig.1 Original average reflectance spectrum

2.2 二維相關光譜譜圖特征

二維相關光譜(two-dimensional correlation spectra，2DCOS)將光譜信號擴展到第二維上增強了光譜分辨率，從而使一維光譜中的弱峰和重疊峰更加清晰[9]。采用二維相關光譜技術，以蛋白質含量作為擾動條件，解析光譜細微特征的變化，尋找與微擾相關的特征信息。

樣品的2DCOS同步譜及對應的三維立體圖如圖2所示。二維相關同步譜圖2(a)中存在自相關峰和交叉峰兩類，位于對角線上的峰為自相關峰，由動態光譜信號自相關得到，對角線外的交叉峰表示相應吸收峰之間的相關程度。自相關峰的強度反映了不同波長下光譜信號隨外部擾動的變化程度[10]，即對蛋白質含量變化的敏感程度。由自相關譜圖圖2(c)可知，波長473，679，734和814 nm 處存在較強的自相關峰，說明該變量處光譜信號對外擾較敏感，是本文所要尋找的與蛋白質相關的敏感變量。在主對角線以外，(473，679)，(679，734)，(734，814)和(473，814) nm 處存在明顯正交叉峰，表明473，679，734和814 nm處吸收峰強度在擾動條件下同時同向變化，來源相同。結合二維相關分析，本研究選擇波長473～814 nm范圍作為冷鮮灘羊肉蛋白質檢測的研究區域。

2.3 預處理

基于所選特征波段，分別采用MSC和SNV預處理方法來消除樣品表面散射、光程變化，顆粒大小及分布不均勻產生的散射影響[11]。經過MSC和SNV預處理后的光譜曲線如圖3所示，2種預處理方法均能有效抑制系統高頻噪音的干擾、提取有用信息、消除光散射等噪音信號，提高光譜分辨率和靈敏度。

2.4 響應面優化

2.4.1 Box-Behnken試驗設計及結果

為實現數據快速降維，減少大量光譜數據處理負擔，消除特征變量間共線性影響，提高模型運算速度，采用CARS[12]和VCPA[13]算法對2DCOS范圍內特征波段進行二次優選，分別提取出16和9個特征波長。然后利用表1所列的因素水平，采用Box-Behnken設計思路，確定蛋白質檢測的可見/近紅外光譜預測模型的最佳組合，目標函數F為響應值，F值越大表明模型的性能越好，表2為試驗因素及水平的組合結果。

圖2 肉樣二維VIS/NIR相關同步譜(a)， 三維立體圖(b)，自相關譜(c)

2.4.2 顯著性檢驗

利用軟件Design Expert 8.0.6對表2的試驗結果進行多元回歸擬合，得到回歸模型方程為Y=70.69+2.16A+1.31B+0.14C+0.86AB-0.19AC+0.059BC-2.59A2+0.42B2-4.84C2

圖3 473～814 nm范圍內原始光譜曲線及預處理后的光譜曲線Fig.3 Spectra of different pretreaments inthe region of 473～814 nm

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

表3 多元回歸模型及方差分析Table 3 Multiple regression model andanalysis of variance

2.4.3 響應面分析

特征優選，預處理和多元校正方法間交互作用的等高線及響應面圖，如圖4所示。響應面中水平方向投影的形狀反映了建模條件交互作用是否明顯，等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。圖4(a)沿A軸方向的響應曲面的坡度比較陡峭，說明特征優選方法對蛋白質檢測模型性能的影響最大，但其與預處理方法交互作用不顯著。圖4(b)等高線形狀為橢圓形，反映出特征優選方法和多元校正方法兩因素交互作用明顯。如果響應面坡度比較平緩，表明建模條件的變化對響應值的影響不大； 如果響應面坡度非常陡峭，則表明模型性能對于建模條件的改變非常敏感，圖4(c)顯示沿C軸方向的響應面坡度比B軸更為平緩，說明預處理方法的變化對響應值的影響比多元校正方法的影響大。該結論與方差分析結果一致： 即各因素對蛋白質可見/近紅外光譜模型預測精度的影響順序為特征優選方法>預處理方法>多元校正方法。

結合表2與圖4的分析結果，得到最佳建模組合為2DCOS-SNV-LSSVM。模型相關系數(Rc/Rp)越接近于1，均方根誤差(RMSEC/RMSEP)越小，則模型效果越好，2DCOS-SNV-LSSVM模型的Rc=0.858 8，RMSEC=0.005 8；Rp=0.860 4，RMSEP=0.005 7，模型具有較高的運行速率和預測能力。

圖4 建模條件交互作用的響應面圖及等高線圖(a)： 特征優選和預處理方法對模型性能的交互作用； (b)： 特征優選和多元校正方法對模型性能的交互作用；(c)： 預處理和多元校正方法對模型性能的交互作用Fig.4 Response surface and contour map of the modeling conditions interaction(a)： The interaction of preprocessing and extraction method;(b): The interaction of extraction method and multivariate analysis;(c): The interaction of preprocessing and multivariate analysis

3 結 論

利用可見/近紅外高光譜成像技術結合Box-Behnken法設計響應面試驗，建立了冷鮮灘羊肉蛋白質含量的高光譜定量分析模型。研究結果如下：

(1)采用二維相關光譜技術，以蛋白質含量作為擾動條件，解析二維相關同步譜和自相關譜，選擇473～814 nm范圍內特征波段作為冷鮮灘羊肉蛋白質檢測的敏感區域。

(2)基于響應面試驗設計，各因素對蛋白質可見/近紅外光譜模型預測精度的影響順序為特征優選方法>預處理方法>多元校正方法，優選出2DCOS-SNV-LSSVM模型具有較高的運行速率和預測能力，其Rc=0.858 8，RMSEC=0.005 8；Rp=0.860 4，RMSEP=0.005 7。

(3)響應面試驗設計綜合考察定量檢測模型建模條件的各種組合，為今后針對不同分析對象的光譜分析模型的優化及提高預測結果的準確性等方面提供理論參考。