X射線光譜技術在生物與生態環境中的應用進展

柳 檢，勞昌玲，袁 靜，孫夢荷，羅立強，沈亞婷*

1. 浙江大學環境與資源學院，浙江 杭州 310058 2. 桂林理工大學，廣西 桂林 541004 3. 中國地質調查局南京地質調查中心，江蘇 南京 210016 4. 北礦檢測技術有限公司，北京 102628 5. 國家地質實驗測試中心，北京 100037

引 言

生物、土壤、海洋沉積物和大氣顆粒物等是環境中化學元素的重要載體，研究各載體中元素的濃度、空間分布和原子配位結構等是揭示元素遷移、轉化和富集的重要前提。X射線光譜技術(XRS)具有制樣簡單、固體進樣、非破壞和多元素分析等技術特點，且隨著X射線光管、多層單色儀、探測器等關鍵技術元件的不斷更新，以及基體校正方法、計算機技術的發展，在一定程度上提高了X射線熒光光譜(XRF)技術對大多數元素的靈敏度(μg·g-1級)[1]，這極大的促進了XRF技術在生物、土壤和大氣顆粒物等樣品分析中的廣泛應用，從而推動了生物地球化學和生態環境事業的發展。

微區X射線熒光光譜(μ-XRF)和X射線吸收譜(XAS)技術作為X射線光譜技術的重要分支，也是生態環境樣品中元素分析的重要手段和支撐技術。μ-XRF技術能夠在微米、亞微米，甚至納米水平上深入到微小環境樣品內部(如生物細胞)，進行深層次的礦物學、生態學和生物學研究，通過獲取樣品中元素的原位分布信息，從而揭示物質的形成條件、元素的動態分布及元素間的相互作用機理等[1]。事實上，μ-XRF并不是一種獨立的技術，它常與其他同步輻射技術(如XAS和μ-XRD)互相補充(圖1)，以提供基于元素空間分布圖中感興趣點位的價態、原子配位結構和官能團構效等[2]。XAS技術包括X射線近邊吸收結構譜(XANES)和擴展邊X射線吸收精細結構譜(EXAFS)，兩者均可原位獲取元素的形

圖1 X射線光譜技術在元素的生物和 環境行為研究中的應用Fig.1 Application of X-ray spectroscopy in the study ofbiological and environmental behavior of elements

態信息，且不受樣品結晶度的限制[3]。

X射線光譜技術的原位、無損分析特點，使其在生物與生態環境領域具有廣泛的應用前景，尤其是μ-XRF和XAS技術的結合。本文對近年來X射線光譜技術在生物與生態環境領域中的應用研究進展進行了評述。首先綜述了μ-XRF和XAS技術在生物與元素相互作用研究中的應用現狀與進展，主要涉及兩種技術在植物、微生物、動物和人體組織對元素吸收、轉運、貯存、解毒和生物代謝過程研究中的應用； 其次評述了μ-XRF，XAS和μ-XRD技術在環境領域的應用現狀與進展，包括大氣系統及大氣顆粒物、海洋系統、土壤與沉積物體系中元素的組成、遷移和轉化過程研究中的應用； 最后探討了X射線光譜技術在該領域應用中還存在的技術難點和挑戰，以期為今后更好地推廣該技術提供參考。

1 XRS在植物中的研究進展

植物是生態系統的第一個營養層級，研究植物中元素的濃度、分布特征和賦存形態是衡量元素在生物鏈中的傳遞效率，以及評估其環境風險的重要依據。近年來，XRF和XAS技術被廣泛應用于植物中元素的(半)定量分析、微區分布和形態轉化研究，尤其是在微米甚至納米尺度下，獲得活體植物中元素的生物環境信息[4]。

1.1 植物中元素的(半)定量分析

XRF技術具有前處理簡單和原位無損分析的特點，在植物樣品的元素定量分析中獨具優勢[5]。如結合波長色散(WD)和能量色散(ED)XRF分析藥用植物中主、微量元素，其前處理過程僅需將植物粉末樣品與石蠟混合(質量比10∶1)，于20 t壓力下壓制成直徑為40 mm樣片后，直接用于WD/ED-XRF測試，光譜數據應用基本參數法計算，即可獲得樣品中17種元素的濃度[6]。也有學者未使用粘結劑，直接對竹筍的粉末樣品進行壓片后，運用WDXRF測試樣品中主微量元素的濃度[7]。另有學者在利用同步輻射X射線光譜技術對Pb的定量分析中，發現Pb Lα特征峰的強度與康普頓峰的強度之比與菜豆樣品中Pb的濃度顯著正相關(R2=0.994 1)，同時利用不同Pb濃度的菜豆莖樣品建立校準曲線，結果顯示： 對于Pb 濃度高于90 μg·g-1時，其與ICP-OES測試結果的相對誤差為1%～9%，而低于90 μg·g-1時，兩者的相對誤差(11%～18%)稍微大一點[5]。因此，由于植物樣品基體的復雜性，在利用XRF技術進行定量分析時，需要采用與樣品基體相匹配的標樣來校正基體效應，以及建立校準曲線，從而獲得較為準確的定量結果。

樣品的整體分析僅代表樣品的平均水平，對于在局部微環境發生的生物化學反應還需從組織、甚至細胞層面進行分析。μ-XRF技術能夠在微米尺度下實現元素的(半)定量分析，通過在微觀尺度上原位測定植物組織中元素的濃度和分布，有助于認識植物對元素的吸收、分配和富集機制。目前，表征植物樣品中元素的微區分布研究，大多是獲得了某一區域內元素富集多、少的相對關系，而很少獲得元素的濃度分布圖，這主要是由于植物樣品基質的復雜性和異質性，導致很難找到與樣品的密度、厚度和基體一致的標樣[8]。

為獲得植物樣品中元素的定量分布信息，在進行μ-XRF分析時，常采用蒙特卡羅模擬[9]、基本參數法[10]和Ray*Ray/Com或Ray/Com(瑞利與康普頓散射峰的比值)[11]進行基體校正。如運用同步輻射共聚焦μ-XRF分析番茄根橫截面中Fe的濃度分布時，基于基本參數法和植物標樣進行基體校正，發現根表層中Fe濃度比根中部Fe濃度高2～3個數量級，且根組織中Fe的濃度都低于10 μg·g-1[12]。由于10 μg·g-1是大多數實驗室微區分析儀器的檢測極限，故很難運用其他技術獲得植物中元素的濃度分布，尤其是進行快速的元素掃描(上述Fe濃度分布掃描時間約1 h)。同時，標準物質的參與對于評估定量分析所需的絕對檢測靈敏度是必不可少的，通過交叉疊加多層Mylar膜以及不同質量Co的方式，在相似質量和厚度的狀態下模擬了浮萍葉片的標樣，運用該標樣進行的μ-XRF分析對活體浮萍葉中Co的檢出限可達250 μg·g-1[13]。

另外，由于活體植物中水分對光子的衰減作用以及不同組織細胞中含水量的變化，XRF對活體植物的絕對準確定量仍然存在較大困難。但有學者報道，對于含水的生物樣品，連續發射X射線的散射作用所產生的強背景往往會降低其檢測靈敏度，通過構建質子誘導的準單色μ-XRF系統的方式能夠增強單色X射線，從而降低檢出限，其檢出限甚至達到ng級[14]。因此，通過合適的校準方法和樣品制備，XRF可以有效地提供活體植物中元素遷移與分布過程中的(半)定量信息。

1.2 植物生長過程中元素的吸收、轉運和解毒機制

從種子萌芽到植株生長過程中，涉及到種子結構中元素的調動、根系的元素吸收、植物體內元素的運輸、以及細胞內元素的貯存和解毒等生物活動。μ-XRF與XAS兩種原位微區分析技術能夠實時、動態研究上述生物活動中元素的分布特征和分子形態，從而揭示植物體內元素的生物行為和功能。

1.2.1 種子萌芽及幼芽生長過程中元素的動態變化

種子的萌芽過程會調動種子結構中儲存的礦質元素，同時也會影響毒性元素的分布和形態轉化。μ-XRF技術能夠在種子萌芽過程中實時、原位、無損掃描元素的分布特征，如μ-XRF分析發現，萌芽期間細胞對礦質元素的調動能力呈現K>Ca>Zn>Mn>Fe的規律，K、Ca被高度調動以促進新生根和葉原基的生長，而Fe主要儲存于液泡中，其調動能力最低[15]。在未發芽的小麥種子中，Zn和P均主要分布在糊粉層，而在萌芽的種子中，部分Zn從糊粉層遷移至種皮，結合XNAES分析發現，在種子萌芽過程中，糊粉層中的鋅-肌醇六磷酸絡合物發生部分水解，從而促進Zn從肌醇六磷酸結構中釋放出來[16]。種子的萌芽也會誘導毒性元素的遷移，如菠菜和香菜種子從萌芽到形成新生根的過程中，Pb主要分布在胚根和新生根中，且種皮、胚乳、新生根的底部中Pb主要以Pb5(PO4)3Cl或Pb3(PO4)2的形式存在，而根尖中僅存在有機鉛形態(乙酸鉛和鉛-富里酸絡合物)，表明有機鉛絡合物是種子萌芽和幼芽生長過程中Pb的遷移和運輸機制，而鉛-磷酸鹽是種子對可溶性Pb的解毒和耐受機制[17]。綜上，μ-XRF和XANES技術是探索種子萌芽和幼芽生長過程中元素的微區分布和形態動態變化的有力手段。

1.2.2 植物根系對元素的吸收作用

植物根系對營養元素或毒性元素的吸收與根際環境條件密切相關，如根際中元素的價態、有機物和氧化還原條件等。如植物對Se(Ⅵ)的吸收能力往往大于Se(Ⅳ)，利用XANES技術分析其原因，發現只有在Se(Ⅳ)暴露下，24 h內豇豆根部大部分的Se轉化為硒代蛋氨酸和硒-半胱氨酸，表明植物體內形成遷移性較低的有機硒，是導致植物易于吸收Se(Ⅵ)的主要原因[18]。另外，有機螯合劑也會影響元素的吸收過程，如EDDS能夠顯著促進黑麥草根對Cu的吸收和運輸，其可使Cu從根到莖的遷移率增加6～9倍，結合SRXRF和XANES技術分析發現，EDDS通過減少Cu在根尖分生組織和主側根連接處的沉積，同時驅動植物體內形成Cu-EDDS螯合物，從而促進Cu向地上部運輸[19]。根系對元素的吸收還會受根際氧化還原條件的影響，如與非淹水處理相比，淹水條件下柳樹根、莖和葉中Cu的積累濃度分別降低了40.7%，62.3%和48.2%，μ-XRF分析發現，淹水條件下Fe和Mn在柳樹根表皮外層呈圓環分布，且表皮層中Cu的信號強度顯著低于非淹水條件，表明淹水條件下根表面形成的Fe/Mn膜抑制了柳樹根對Cu的吸收[20]。從上述研究實例，可以發現不同價態的元素、螯合劑和土壤淹水條件均通過促進元素在植物體內的轉化或改變植物對元素的區隔機制，來影響根系對元素的吸收。

1.2.3 植物中元素的運輸和生物轉化

植物中元素的運輸主要包括元素從根表皮到中柱的遷移、木質部的運輸和韌皮部的運輸三個過程。首先，根表皮到中柱的元素遷移過程是植物體內元素再分配的重要前提，該過程需要元素依次穿過表皮、皮層、內皮層再到達中柱。結合μ-XRF和XANES技術可表征元素從表皮到中柱的運輸過程和形態轉化，如研究發現CuO NPs雖然難以穿過多數根內皮層的凱氏帶進入中柱，但仍可通過凱氏帶結構被破壞的區域(主側根連接處)進入中柱，同時進入水稻的CuO NPs將部分轉化為Cu(Ⅱ)與半胱氨酸、檸檬酸和磷酸鹽的絡合物，以及還原成Cu2O[21]。

隨后，元素通過水分的蒸騰作用經木質部從根部直接運輸到地上部。根、莖、葉柄橫截面中元素的空間分布和木質部汁液中元素的濃度分析是揭示木質部中元素運輸的重要途徑，如μ-XRF掃描發現Cu主要分布在杞柳根的中柱，以及莖、葉柄的維管組織，同時相關性分析顯示木質部汁液中Cu的濃度與莖中Cu的濃度顯著正相關(r2=0.97,p<0.01)，表明Cu主要通過木質部從杞柳根部運輸至地上部[22]。最后，元素也可經韌皮部從老葉或成熟葉運輸至新葉或新生根[23]。如μ-XRF分析，發現Cd在積累型東南景天老莖的韌皮部中也明顯分布，而在新莖的髓心和皮層中明顯分布，這有力地證明了韌皮部介導的Cd轉運在Cd從老葉到新葉的再活化過程中起重要作用[24]。因此，植物的關鍵部位(中柱、木質部和韌皮部)中元素的微區分布是揭示元素在植物體內遷移過程的重要依據。

為實現元素在木質部和韌皮部的長程運輸中，進入植物細胞的元素常發生形態轉化，尤其是轉化為金屬有機絡合物[25]。在大多數植物的韌皮部和木質部汁液中，元素的濃度在μmol·L-1(幾十～幾百μg·L-1)范圍[26]，故在如此低濃度下，準確鑒定韌皮部、木質部中金屬絡合物的分子結構是闡明植物中金屬元素運輸過程的巨大挑戰之一。目前單配體的伏安滴定法和高效液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜技術常用于分析木質部汁液中元素的形態，但這兩種方法可能存在配體吸附、形成的絡合物不穩定等問題，從而影響形態分析的準確性[27-28]。然而，XAS技術能夠解決上述問題，并實現低濃度(μg·L-1級)生物組織液的元素形態分析，如利用同步輻射全反射X射線熒光擴展的XANES分析技術，可以鑒定As濃度低至30 μg·L-1的黃瓜木質部汁液中As的形態，原位活體實驗結果顯示，隨著As暴露時間的延長(0～48 h)，As的價態從As(Ⅲ)轉化為As(Ⅴ)[29]。因此，依靠XANES技術分析木質部、韌皮部中元素的形態是闡釋植物中元素運輸過程的重要途徑。

1.2.4 植物中元素的貯存、耐受和解毒機制

為降低游離金屬離子對植物的毒害，植物細胞可將重金屬沉積在細胞壁和區隔在液泡。細胞壁是元素進入細胞質的第一道屏障，其組成成分對金屬元素具有較強吸附能力，如在pH 5.0～6.0范圍內，美洲商陸根細胞壁吸附的Mn高達5.4 mg·g-1，同時XAS分析，發現吸附到根細胞壁的Mn(II)通過內殼層配位與細胞壁的羧基結合[30]。與之類似，黑麥草在Pb暴露下，根和葉細胞的Pb-L3XANES形態分析，發現大多數Pb(50%～65%)與細胞壁成分的多糖結合[31]。擬南芥在Cd暴露下，葉片表面毛狀體細胞的Cd-L3XANES形態分析，發現75% Cd與細胞壁中的O/N配體結合，僅25% Cd與細胞壁中含S的配體結合[32]。為闡明海州香薷根細胞的細胞壁中Cu的結合配體，有學者利用改性的細胞壁吸附Cu2+，發現細胞壁的羥基、羧基和氨基是Cu2+的主要結合位點[33]。因此，細胞壁中的羥基、羧基和氨基等帶負電的配位基團，通過與金屬離子發生離子交換、吸附、配位絡合和沉淀等作用，使進入植物細胞的金屬元素沉積于細胞壁[34]。

當植物細胞壁上的結合位點與金屬離子的結合量達到飽和后，多余的金屬離子將穿過質膜進入細胞內部。細胞內液泡的區隔化是植物細胞對金屬元素的另一重要解毒機制[35]。如XANES分析發現，當秋茄根細胞壁對Cd的固定趨于飽和后，細胞內大多數的Cd2+被運輸至液泡，并與檸檬酸和草酸絡合[36]； 在Pb脅迫下，綠藻細胞中約10% Pb與GSH結合，形成Pb(GSH)3絡合物[37]； 擬南芥分別暴露在As(Ⅲ)和As(Ⅴ)環境中，在其葉細胞中鑒定出32.0%和18.9% As(Ⅲ)-GSH[38]； 紫花苜蓿在Hg暴露下，其根細胞中Hg以43% Hg-PC，34% Hg-Cys和23%甲基汞形式存在[39]，表明液泡中的谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、有機酸和植物螯合肽(PC)等通過與金屬元素形成低毒性或無毒的有機絡合物，以實現元素的細胞解毒。

2 XRF在微生物、動物與人體組織中的研究進展

X射線光譜技術也廣泛應用于微生物、動物和人體組織中元素的分布和形態研究，結合μ-XRF和XANES技術可研究微生物作用下元素的氧化還原、生物礦化和沉淀固定，探索動物與元素的交互作用及其對重金屬環境的適應機制，以及揭示元素在人體組織中的代謝行為等。

2.1 微生物與元素的相互作用

微生物普遍存在于環境中，在元素的生物地球化學循環過程中扮演著重要角色，其可通過對重金屬的溶解、吸附、形態轉化等途徑影響元素的循環過程。結合XRF和XAS技術，可探究微生物作用下元素的地球化學循環過程，并揭示微生物對重金屬的解毒機制，從而為重金屬污染的生物修復提供理論依據。

2.1.1 微生物作用元素的遷移過程

砷的氧化還原機制、砷在固相和液相之間的循環過程、以及砷從沉積物中釋放進入水體的機理等一直是高砷沉積物和地下水研究的重要內容。通常，As(Ⅲ)比As(Ⅴ)的毒性更大，無機砷化合物的毒性強于有機砷化合物[40]。XANES分析發現在還原條件下，溶液中的砷主要以As(Ⅲ)形式存在，固相中吸附的砷也有74%～85%以As(Ⅲ)的形式存在，表明具有較高的生態風險； 當環境中加入氧氣后，在原生微生物的作用下，溶液中As(Ⅲ)的含量降低，但As(Ⅴ)的含量并未增加，表明氧化條件可降低砷的溶解性，使其被還原為As(Ⅴ)并吸附于固相，從而降低As的生態風險[41]。另有研究利用XANES技術研究含鐵礦物中As的吸附-解吸附行為，發現缺氧的稻田土壤中分離的地衣桿菌Geobactersp.OR-1可促進吸附于水鐵礦中砷的異化還原與釋放，Geobactersp.OR-1作用可將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)，也可將Fe(Ⅲ)還原為Fe(Ⅱ)，導致原本吸附于水鐵礦表面的砷釋放進入稻田環境中，從而增加了As進入食物鏈的生態風險[42]。因此，XANES技術可用于研究微生物作用下As的遷移和轉化過程，并揭示礦物表面As的吸附與釋放行為。

2.1.2 微生物作用元素的形態轉化

2.1.3 微生物促進重金屬的修復

微生物通過促進重金屬的生物礦化將重金屬沉淀，從而降低重金屬的生物有效性，這是微生物修復重金屬污染的重要途徑之一。生物礦化主要包括磷酸鹽礦化、碳酸鹽礦化和硫化物礦化等。Stylo等[47]利用XAS探究了希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1對土壤中U(Ⅵ)的生物礦化過程，發現希瓦氏菌可將U(Ⅵ)轉化為溶解性較差的UO2礦物，環境中加入S，Si和P元素可促進胞外聚合物(EPS)的形成，由于EPS可提高細胞對U(Ⅵ)的吸附及促進成核，同時這些EPS中的細胞色素可促進U(Ⅵ)的還原，使被還原礦化形成的UO2比例增加55%～95%，從而有利于U(Ⅵ)的生物修復。另有學者結合XRD和EXAFS技術研究了真菌作用鈾礦物的氧化物溶解和生物礦化過程，發現暴露于UO3和U3O8的真菌通過分泌大量的草酸，促進U的溶解和(UO2)2+絡合物的形成，同時可溶的(UO2)2+進一步與磷結合，形成UO2HPO4或[UO2(HPO4)2]2-，并最終礦化形成結晶度較好的磷酸鈾酰礦物[48]。與之類似，利用XRS技術探究草酸青霉SL2(PenicilliumoxalicumSL2)對Pb的修復機制，發現Pb2+暴露后，細胞分泌的草酸、檸檬酸、磷酸氫根、GSH均有明顯的增加，菌絲體胞內形成了納米級和微米級的含Pb次生礦物，主要為草酸鉛、檸檬酸鉛、磷酸氫鉛及Pb-GSH(鉛-谷胱甘肽)絡合物，由此判斷GSH的合成、有機酸的分泌和有機磷的水解作用促進了Pb的形態轉化和生物礦化[49]。

2.2 動物與元素相互作用

底棲動物(蚯蚓等)在生態系統的物質循環中發揮著巨大作用，其不僅能夠耐受并富集環境中的(類)重金屬元素，還可以通過自身活動改善土壤環境和性質，從而對植物生長和土壤微生物菌群等產生影響。μ-XRF和XAS技術在原位測定元素分布和形態方面具有獨特優勢，能夠為底棲動物與元素作用機制研究提供關鍵信息。

2.2.1 蚯蚓與土壤生態系統

底棲動物與土壤生態系統的交互作用能夠影響土壤中(類)重金屬的遷移和環境行為。如研究蚯蚓和豆科植物對土壤硒行為的交互作用(圖2)，發現蚯蚓作用下土壤Se向植物的遷移率增加4%，進一步分析Se的XANES形態，發現在硒酸鹽環境下，蚯蚓的存在使植物中有機硒形態(如SeMet和CysSeSeCys)的百分比大大增加(高達34%)，而單質Se的比例明顯降低，表明蚯蚓明顯增加了植物對Se的吸收和轉移，從而提高植物地上部的Se積累[50]。在污染的土壤中引入蚯蚓可改變土壤中元素的形態、提高元素的可遷移性和生物可利用度，比較三種類型的蚯蚓(Eiseniaveneta,Lumbricusterrestris和Allolobophorachlorotica)對污染土壤中Cu，Pb，Zn和As元素的遷移性和可利用性的影響，并在土壤表面種植黑麥草來評估植物對重金屬的吸收，發現L.terrestris和E.Veneta不僅能夠增加Cu和Zn的遷移率，還能增加有效性更高的金屬形態(金屬的自由離子)的比例； 另外，相對于其他兩種類型的蚯蚓，L.terrestris能夠產生更多的土壤排泄物，并促進黑麥草對重金屬的吸收[51]。

圖2 蚯蚓與土壤生態系統中Se的遷移轉化[50]Fig.2 Translocation and transformation of Se in earthworm and soil ecosystem[50]

2.2.2 蚯蚓中金屬元素的生物過程和行為

蚯蚓常攝食和分解凋落物，以實現生態環境中養分和毒性元素的循環。為闡明蚯蚓從土壤中吸收、轉運和富集重金屬的生物過程，結合μ-XRF和XAS技術研究土壤和蚯蚓中Zn和Pb的分布特征和形態轉化，發現在蚯蚓前、后消化道均有Zn的分布，而Pb主要分布在后消化道的黃色體細胞中，XANES分析顯示土壤和蚯蚓中Zn的形態相似，Zn主要與氧配體結合，其結構與Zn3(PO4)2相似，其次與S配體結合[52-53]； 然而，土壤和蚯蚓中Pb的形態存在差異，土壤Pb呈單殼層配位結構(Pb-S)，而蚯蚓的黃色體細胞中的Pb呈雙殼層配位結構(Pb-O與Pb-S)，表明蚯蚓的黃色體細胞在Pb的解毒和富集中起重要作用，而且蚯蚓對營養元素Zn和毒性元素Pb的吸收、代謝過程存在顯著差異[52]。與之類似，蚯蚓暴露于含Ag NPs的土壤環境中，μ-XRF分析發現Ag主要分布于消化道表面的氯生組織、腎小管以及剛毛附近[54]，同時XANES分析發現蚯蚓體內的Ag可能與富含硫醇的蛋白質結合[55]。上述研究表明，元素的分布和形態研究是揭示動物中元素的生物過程、解毒和富集機制的重要途徑。

2.2.3 其他動物組織結構中元素的分布和形態

為探索蚤狀鉤蝦對高As環境的適應和生存機制，結合μ-XRF和μ-XANES技術研究蚤狀鉤蝦從葉片攝食、消化和貯存As的過程，發現As主要沿蚤狀鉤蝦的腸道系統分布，并在作為食物來源的葉片中，鑒定出68%砷酸鹽和29%一甲基砷酸鹽，攝入腸道系統后，葉片中的As被轉化為46%～56%二甲基砷酸鹽和23%毒性更高的亞砷酸鹽，而腸道外的其他組織中，As主要以甲基砷的形式存在，其次是As(Ⅲ)-S絡合物(10%～21%)，表明食物中的主要As形態(砷酸鹽)經蚤狀鉤蝦消化，并在腸道發生甲基化和還原，隨后進入其他組織進一步甲基化或與S結合[56]。

含鍶藥物對骨質疏松癥患者具有治療作用，為探索含鍶藥物如何在骨骼中發揮作用，有學者利用2D μ-XRF和3D同步輻射μ-XRF技術掃描了雷尼酸鍶和檸檬酸鍶處理的大鼠肱骨中鍶元素的分布，發現兩種鍶鹽處理下，鍶具有相同的空間分布，其大量沉積于肱骨骺板下方的骨小梁區域，且肱骨中高鈣分布區域與低鍶分布區域相對應，同時兩種鍶鹽處理下，鍶層厚度(1.364～1.382 mm)無顯著差異(p=0.920 1)，表明鍶鹽作用下新形成的骨骼能夠通過鈣原子的取代或表面交換將鍶摻入羥基磷灰石晶體中，從而增加骨骼的強度和降低骨質疏松性骨折的風險[57]。

2.3 人體組織中元素的分布和形態

研究人體組織中重金屬的濃度、分布和形態特征，有助于揭示重金屬對人體健康的影響和人體內重金屬的代謝過程與作用機制，人發和指甲作為人體的附屬組織，可直接采集離體組織用于元素的分析測試； 而骨骼常位于真皮組織層下，其元素的分析測試還依賴于原位活體的分析方法，如活體XRF原位分析技術。

2.3.1 人發和指甲

2.3.2 人體骨骼

活體XRF分析技術通過直接測定人骨中毒性元素的含量和獲得骨細胞中毒性元素的原位信息，以探究毒性元素對人體健康的影響及其體內代謝過程與作用機理。如有學者采用109Cd激發Pb的K系譜線，原位活體分析了人體脛骨和根骨中Pb的含量，發現普通人群的骨鉛濃度在0.4～22.7 μg·(g 骨礦物質)-1，而鉛鋅礦區附近居民骨鉛含量較高，其Pb濃度高達73.9 μg·(g 骨礦物質)-1，表明采礦活動潛在威脅著周邊居民的人體健康。攝入人體的毒性元素也會進入骨細胞中，影響骨細胞的存活和功能。如通過結合μ-XRF和XANES技術研究Cr進入骨細胞的過程、細胞分布和形態特征，發現Cr3+暴露下，進入成骨細胞的Cr3+聚集在細胞核及細胞核周圍，并與羥基和磷酸根結合，形成Cr(OH)3和CrPO4； 而Cr6+暴露下，進入成骨細胞的Cr6+分散于細胞內，并完全轉化成Cr3+，表明Cr3+和Cr6+的骨細胞作用機制存在顯著性差異，且細胞內Cr6+還原成Cr3+、以及氫氧化鉻和磷酸鉻的沉積是成骨細胞對Cr的主要代謝和解毒機制[61]。因此，XRF和XANES技術是原位監測和分析毒性元素對人體骨骼影響和相關機理的有效手段，其可為診斷重金屬在人體中引起的生物致病機制提供直觀數據。

3 XRS在大氣、海洋和土壤沉積物中的研究進展

海洋、土壤沉積物和大氣顆粒物等是環境中營養元素和毒性元素的重要載體。獲得各載體樣品中元素的組成、微區分布、形態特征以及礦物結構信息是揭示環境中元素的遷移、轉化和累積等環境行為的關鍵。近年來，X射線光譜技術常用于監測和評估重金屬的環境風險、研究環境微粒物對重金屬的載運機制和解析重金屬的環境歸趨、演化等。

3.1 大氣系統及大氣顆粒物

大氣環境中，能量色散X射線光譜(EDXRF)和全反射X射線熒光光譜(TXRF)常用于大氣重金屬污染的植物監測和重金屬污染源的識別。汽車尾氣和大氣顆粒物是大氣環境中的兩大主要污染物，其元素組成、濃度和形態特征是影響大氣中重金屬污染程度的重要因素。μ-XRF和XANES技術常用于衡量元素在大氣環境中的遷移潛力、解析重金屬的污染來源以及識別大氣顆粒物中礦物的轉化。

3.1.1 大氣中重金屬污染的監測

植物監測為大氣環境的污染評估提供了一條便捷而有效的途徑，苔蘚、植物葉片和樹皮已被廣泛應用于大氣中重金屬的污染監測。如利用EDXRF技術檢測3年間苔蘚樣品中元素的濃度變化，發現3年間Br，Ca，Fe，Zn，Rb，Sr和Pb的濃度無顯著性差異，表明已知的污染源無顯著變化和/或沒有新的污染源[62]。植物葉片常充當氣溶膠和氣體顆粒物的沉積池，利用TXRF技術直接測定6種樹木葉片中元素的濃度，發現榆樹是最適合用作生物指示劑的樹種，馬可尼公園是大氣污染風險最高的公園，同時利用多元統計分析樹葉中沉積重金屬可能的來源，發現車輛排放物是Cu，Fe和Pb元素的主要污染源[63]。另外，樹皮也常用于監測大氣污染和識別大氣的污染源，在EDXRF技術測定樹皮中元素濃度的基礎上，應用主成分分析識別元素的污染源，發現樹皮中Al，Ba，Cu，Fe，Mn和Zn主要來源于汽車剎車、輪胎的磨損以及道路揚塵的再懸浮[64]。上述研究實例表明，XRF技術在大氣污染物的生物監測和重金屬污染源的識別中發揮了重要作用。

3.1.2 汽車尾氣中元素的環境風險

汽車尾氣煙塵常攜帶重金屬、硫化物和氯化物等，這些攜帶物可對汽車行駛道路周圍的土壤/粉塵、植被和空氣產生污染。為評估汽車尾氣煙塵中重金屬對大氣環境的危害，利用EDXRF測定了汽車尾氣煙塵中元素的濃度，同時以Ca為參考元素計算樣品中元素的富集因子(EFcrust)，發現Cr，Mn，Ni，Cu，Zn，Br和Pb在汽車尾氣煙塵中高度富集(EFcrust>10)，尤其是重金屬Cr，Pb和Zn的污染最為嚴重，三者的EFcrust分別高達696，72.4和183[65]。元素的形態分析可進一步衡量元素在大氣環境中的遷移能力和生態毒害。如利用XNAES技術鑒定車輛廢氣顆粒物中Pb和Zn的形態，發現Zn主要以ZnCl2的形式存在，Pb主要由3種化合物組成，包括52% Pb3(PO4)2，24% PbSO4和23% PbCO3，由于ZnCl2易溶于水，而Pb3(PO4)2和PbSO4在環境中較穩定，故車輛廢氣顆粒物中Zn的遷移性較高，而Pb的遷移能力相對較低[66]。上述研究表明，結合EDXRF和XANES技術，可從元素總量和形態層面準確評估汽車尾氣煙塵中元素對生態環境產生的危害程度。

3.1.3 大氣顆粒物的元素組成及來源解析

大氣顆粒物是重要的空氣污染物之一，其環境毒害程度取決于顆粒物的尺寸、元素組成、顆粒物的粒徑分布和元素形態等。如利用μ-XRF技術探究不同粒徑的大氣顆粒物中元素的分布特征，發現Ca和Ti主要分布在>2 μm粗粒徑顆粒中，而V，Cr，Mn，Ni，Zn，Cu，Pb，Cl和S主要分布在0.1～1.0 μm的顆粒物中，且這些元素的富集程度隨粒徑的增大而減小[67]。另有研究通過對比冶金工廠附近PM10和PM2.5中As的濃度和形態，探究了不同粒徑的大氣顆粒物中As的潛在毒性，EDXRF測試發現PM10中As濃度的平均值(30 ng·m-3)比歐洲目標值高4倍，而PM2.5中As的濃度是PM10中As濃度的一半，但兩種顆粒物中As的潛在毒性不完全取決于As濃度的高低，還與As的形態密切相關，XANES分析發現，PM10中As以As(Ⅴ)為主，而PM2.5中As以毒性更高的As(Ⅲ)為主，故相比大粒徑的顆粒物(PM10)，小粒徑的顆粒物(PM2.5)具有更高的As毒性[68]。與之類似，利用XANES技術表征粗(>2.1 μm)、細(≤2.1 μm)大氣顆粒物中Pb的形態，通過與道路灰塵、垃圾焚燒飛灰和燃油飛灰中Pb形態進行對比，發現粗顆粒中的Pb主要來源于道路灰塵，而細顆粒中的Pb主要來源于城市生活垃圾焚燒和重油燃燒產生的飛灰[69]。綜上，μ-XRF和XANES技術是評估大氣顆粒物中毒性元素的危害潛力和污染來源的有力工具。

3.2 海洋系統

X射線光譜技術在海洋微塑料、海洋沉積物和海洋動植物的元素分析中應用廣泛，利用XRF技術定量分析海洋環境樣品中元素的濃度，可準確評估海洋環境中重金屬的生態風險，同時結合μ-XRF和XANES技術探索鐵錳結核、錳-硫化物和富稀土底泥等沉積物中元素的分布和形態，能夠揭示海底沉積礦物的形成機制及其吸附重金屬、稀土元素的過程； 表征海洋典型動植物中元素的分布和形態特征，不僅有助于認識海洋動植物細胞中金屬的富集和解毒機制，還可為古海洋環境演化研究提供幫助。

3.2.1 海洋微塑料中元素的生態風險

微塑料是海洋環境中最重要的污染物之一，其不僅會通過纏結和吞咽作用直接影響海洋生物的生存，還會作為運輸和生物蓄積有機、無機化學物質的媒介，間接威脅海洋生物的生存。快速獲取微塑料中元素的定量信息是準確評估微塑料潛在生態風險的重要前提。近年來，配置低密度模式和小光斑設備的便攜式X射線熒光(FP-XRF)光譜儀常用于測定微塑料中元素的濃度，如有學者利用FP-XRF分析微塑料中元素的濃度，發現海灘微塑料中Cd，Cr和Pb的濃度分別高達4 310，1 330和6 130 μg·g-1，其分別超過《歐盟有害物質限制指令》所規定限制值的43.1，1.3和6.1倍[70]，進一步評估微塑料中元素的生物可給性，發現模擬海鳥胃液提取液中Cd和Pb濃度分別高達50和8 μg·g-1，其分別比海鳥可食用的安全閾值高出50和4倍[71]。除了Cd，Cr和Pb污染外，Br和Sb也是微塑料中常見的污染元素，其主要源于含Br和Sb阻燃劑的使用，FP-XRF測定微塑料中Br和Sb的濃度，顯示兩者的平均濃度高達1 410和621 μg·g-1，且模擬海鳥胃液提取液中Br和Sb濃度分別高達14和1.4 μg·g-1，表明微塑料所運載的毒性元素潛在威脅著海洋生物的生存[72]。

3.2.2 海洋沉積物中元素分布與物源識別

海洋鐵錳結核中富鐵和富錳層呈現出洋蔥狀交替分布模式，海底水環境季節性循環是產生該分層模式的主要因素[73]。在春季，海底水中氧氣降低，進入結核的Mn通量超過Fe通量，此時的亞氧條件更有利于Mn4+還原成Mn2+； 在夏季，底部海水中缺氧的增加，將導致進入結核的Fe通量高于Mn通量，促進富Fe層的沉積[74]。這些富鐵和富錳層可吸附海洋中的微量元素，μ-XRF和XAS是研究鐵錳結核中微量元素吸附和分配的重要手段，μ-XRF掃描發現Zn主要吸附在富Mn層，而As主要吸附在富Fe層，EXAFS分析表明海底鐵錳結核中的錳相主要是結晶性較差的水鈉錳礦，其與土壤中報道的錳氧化物相似，Zn易于吸附到水鈉錳礦上，并形成四面體的配位結構，這主要是由于四面體結構比八面體結構更好地補償由Mn3+取代Mn4+引起的層電荷不足，而As主要以As(Ⅲ)吸附在水鐵礦上[75]。因此，探究海底鐵錳結核中元素的分布和形態，可揭示鐵錳結核的生長模式和形成環境。

探索海洋沉積物中Mn的富集機制是揭示錳-硫化物形成的重要途徑，結合Micro-XRF和SEM-EDS技術，發現塊體疊層中Mn的分布規律與Fe和S的分布一致，表明硫化物結合的Mn與草莓狀黃鐵礦聚集體有關[76]。為進一步探究硫化物結合的Mn是否來源于Mn對內生鐵-硫化物礦物的同構替代，利用EXAFS技術表征了沉積物中Mn的配位結構，發現Mn—S鍵長(2.3 ?)大于黃鐵礦中Fe—S鍵長(2.2 ?)，但與四方硫鐵礦中Fe—S的鍵長(2.26 ?)相近，同時鑒定出樣品中Mn與S的配位結構(四面體)與黃鐵礦中Mn—S的配位結構(八面體)不同，而與四方硫鐵礦中Fe—S的配位結構(四面體)相同，表明硫化物結合的Mn未進入黃鐵礦結構中，而是同構替代了四方硫鐵礦中的Fe[76]。另有研究發現大洋沉積物中釔與鐵的空間分布一致，由于鐵信號主要來源于熱液活動形成的氫氧化鐵顆粒，故沉積物底泥中的釔可能來源于大洋中脊的熱液活動[77]。因此，元素的分布、價態和原子的配位結構有助于闡釋海底沉積礦物的形成機制和潛在來源。

3.2.3 海洋典型生物對海洋環境的生物指示作用

有孔蟲是一種海洋生物指示劑，其碳酸鈣殼體中的Ca，Mg和Zn等微量元素能夠指示水環境的溫度、海洋演化、全球環境與氣候變化等。有孔蟲殼體方解石的Mg/Ca比值常用作指示海洋溫度，較高的溫度有利于鎂取代鈣吸熱，但有孔蟲中Mg的摻入可能更為復雜，XANES分析發現有孔蟲方解石的礦物結構與白云石((CaMg)(CO3)2)相似，且Ca和Mg在晶格中占據等效八面體位置，表明Mg可以替代有孔蟲方解石中的Ca[78]。有孔蟲殼體方解石的Zn/Ca比值常用于認識海洋水化學和古環流，結合μ-XRF和XANES技術探索有孔蟲殼體中Zn的摻入機制，觀察到殼體中Zn和Ca的分布相似，且50%的Zn以鈣替代物或以四配位氧吸附離子的形式存在于方解石中，部分Zn以閃鋅礦(形成于早期成巖過程)和磷酸鋅的形式存在，還有少量的Zn以水鋅礦的形式存在，由于水鋅礦來源于有孔蟲的細胞過程，故有孔蟲殼體中Zn的摻入也與其細胞過程相關[79]。綜上，有孔蟲殼中元素的分布和化學形態可揭示微量元素從海水環境到有孔蟲鈣化位點的遷移和摻入過程。

珊瑚中微量元素S，P，Ca和Mg的分布和形態能夠指示珍貴珊瑚的生長特征和棲息地的環境。據報道，珊瑚骨骼中的Mg可指示海水溫度，其含量隨海水溫度的升高而增加，海水溫度每升高1 ℃，珊瑚骨骼中Mg/Ca比值將增加0.004～0.006[80]。珊瑚的生長會形成明亮(低有機質區)和黑暗(高有機質區)交替的生長環帶[81]，μ-XRF分析顯示，紅珊瑚骨骼中S，P和Mg沿生長環的明暗帶分布，S和P主要分布在富有機質的暗帶中，而Mg則分布在低有機質的亮帶中[82]。進一步的XANES形態分析，發現CaSO4是珊瑚骨架和共膠層中S的主要形態，即S能夠以硫酸鹽的形式取代碳酸根離子進入方解石骨架中，同時在XANES光譜圖的2 480.1 eV處觀察到一個較低的能量峰，表明珊瑚骨架中也存在硫酸氫鹽或硫酸軟骨素，由于硫酸軟骨素是一種粘多糖，其常以蛋白聚糖的形式附著在動物組織的蛋白質上，故珊瑚中的S能夠以無機和有機硫形式共存[83]。上述研究表明，元素分布和形態分析有助于更準確地認識珊瑚中S元素的環境行為，并為探索S元素在生物礦化中的作用提供重要信息。

3.3 土壤與沉積物體系

土壤和沉積物體系中，μ-XRF，XANES和μ-XRD技術被廣泛應用于評估元素的生物有效性、闡釋有機質改變元素遷移潛力的作用機制、研究金屬納米顆粒物的遷移和形態轉化，以及探索磁性粒子對重金屬的載運行為。

3.3.1 土壤中元素的生物有效性

元素的形態鑒定是準確評估土壤中元素的生物有效性的重要方式。雖然化學提取法是表征土壤中元素生物有效性的一種常用手段，其可提供土壤中元素形態分布的半定量信息，但其無法提供元素的配位結構信息[84]。結合XANES技術和化學提取手段表征礦區周圍土壤中As的形態，發現土壤As主要以砷酸鹽礦物的形式存在，其結構與水砷鐵石相似，同時還存在部分砷菱鉛礬； 順序提取也表明土壤As主要與結晶態的Fe氧化物結合，結晶態的Fe氧化物的溶解度比非晶態的Fe氧化物低5倍[85]，故兩種方法一致表明，該礦區土壤中As的遷移潛力較低[86]。相比礦區土壤，農業土壤中元素的生物有效性較高，其根本原因是兩類土壤中元素形態的差異，XAS分析發現在礦區土壤中，Cu(Ⅱ)主要通過內殼層絡合作用吸附到Fe(Ⅲ)氧化物上[87]； 而在污染的農業土壤中，Cu(Ⅱ)主要與土壤有機質(SOM)絡合，并形成Cu—N或Cu—O的雙齒絡合物，這主要是由于農業土壤中植物的根系作用，導致農業土壤中形成的SOM較多(2.2%～75%)[88]，而礦區土壤中SOM較少(～0.55%)[87]。因此，雖然礦區土壤中Cu的濃度遠高于農業土壤，但礦區土壤中Cu的生物有效性往往低于農業土壤，故與元素的總量相比，元素的形態更能直觀地反映出土壤中元素的遷移性和生物有效性。

3.3.2 土壤有機質對元素遷移能力的影響

有機質提供的有機配體能夠與土壤中的金屬元素發生絡合和吸附作用，從而改變土壤中元素的遷移能力和生物有效性。有研究者結合順序提取和XANES技術研究了茶多酚(TP)對土壤中Pb形態的轉化和Pb遷移能力的影響，發現相比無TP處理組，添加TP使茶葉土壤中可交換態Pb、吸附態Pb和可還原態Pb的比例分別降低了1.5%，9.1%和5.6%，而有機結合態鉛(Pb-TP和鉛-富里酸)的比例增加了29.7%，同時殘渣態鉛(Pb5(PO4)3Cl)的比例也增加了6.6%，表明TP的添加顯著改變了土壤中Pb的形態，并降低了土壤中Pb的可遷移性[89]。XAS分析還發現在低Pb濃度下，1個Pb2+易與2個來自不同腐殖酸(HA)分子的羧基(COO—)配位，并形成COO—Pb(Ⅱ)—COO—橋型結構的二齒或多齒絡合物，通過促進腐殖酸分子之間的聚合，來增加鉛-腐殖酸絡合物的穩定性，從而降低土壤中Pb的可移動性[90]。與之相反，有報道稱添加HA能夠將污染土壤中Pb的生物有效性提高10%～30%，XANES分析其機理，發現HA通過將穩定的磷氯鉛礦(22%)和白鉛礦(19%)轉化為可遷移的Pb-HA絡合物，以提高土壤中Pb的生物有效性[91]。因此，土壤有機質與重金屬的配位結構具有復雜性和不確定性，其可能降低或升高土壤中重金屬的可遷移性和生物有效性。

3.3.3 土壤中金屬NPs的遷移和轉化

土壤中NPs因其組成和納米尺度，導致其生態毒性往往比溶解態金屬離子的毒性更大，故NPs具有較高的遷移潛力和生物鏈傳遞風險。如結合μ-XRF和μ-XANES技術，分析發現ZnO NPs從土壤遷移到大豆后，主要是以具有Zn—O配位結構的鋅-檸檬酸鹽存在于莖的韌皮部； 而CeO2NPs從土壤遷移到大豆后，79%的Ce仍以納米形式存在于莖結節的表皮中，同時還有部分Ce(Ⅳ)還原成Ce(Ⅲ)[92]。類似的，利用μ-XRF和μ-XANES技術研究農業土壤中Ag-NPs的命運，發現土壤中的Ag-NPs易發生硫化，形成極難溶解的Ag2S，當種植小麥4周后，10% Ag2S轉化成銀-硫醇化合物和無定型Ag2S，表明小麥的根際作用促進土壤中Ag2S的形態轉化和部分溶解[93]。濕地土壤中NPs的遷移轉化行為研究，發現添加1 000 mg·kg-1CuO NPs可使CaCl2提取水稻土壤中Cu的濃度提高374倍，同時土壤中Cu的分子形態受水稻生長期的影響： 幼苗期，土壤中71.5% CuO NPs轉化成銅-腐殖酸結合態； 成熟期，土壤中的CuO NPs完全轉化成銅-腐殖酸、Cu2S和Cu2O[94]。因此，在土壤-植物系統中，植物的根系作用通過促進土壤中NPs的形態轉化，來提高土壤中金屬NPs的可遷移性和生物有效性。

3.3.4 土壤中重金屬磁性載體的環境意義

土壤中磁性粒子(TMPs)是重金屬污染物的重要載體，在微米尺度上認識TMPs中Fe的礦物相和重金屬的空間分布，有助于闡釋污染土壤中TMPs的磁性特征及其與重金屬的作用關系。如μ-XRF技術掃描鋼鐵工業區污染土壤中微米級TMPs中元素的分布，發現Co，Cr，Mn，Ni和Pb共同分布在8～96 μm大小的富Fe區域，結合XANES分析，表明磁鐵礦和鐵合金是TMPs中主要的磁性來源和重金屬載體[95]。單個球形TMPs(直徑30 μm)的μ-XRF分析，還發現TMPs中富含Fe，Pb，Cd，Zn和Cu，進一步的μ-XRD分析表明這些重金屬離子通過取代磁鐵礦或赤鐵礦晶格中的Fe2+和/或Fe3+而摻入到鐵氧體結構中，且鐵氧體的磁性越高，其結合重金屬的能力越強[96]。為確定土壤中的重金屬來自何種磁性相，結合μ-XRF和μ-XANES分析，發現鋼渣和煤灰中的鐵合金、磁黃鐵礦和TMPs是污染土壤中的主要磁性相； Co，Cr，Cu和Mn主要來自鐵合金，而Ti、Zn和As來自煤灰的鐵合金和TMPs[97]。因此，TMPs能夠吸附土壤中的重金屬，可作為重金屬來源的示蹤劑，揭示土壤中重金屬污染物的來源。

4 總結與展望

縱觀近年來國內外學者對生物地球化學與生態環境中元素的遷移規律、環境行為和生物功能的研究，可以發現(1)通過合適的校準方法和樣品制備，XRF可有效地提供活體生物樣品中元素遷移與分布過程中的定量數據； (2)μ-XRF和XAS技術是能夠表征生態環境樣品中亞微米尺度的元素分布和原子尺度的元素形態，其原位分析特征在克服因樣品制備導致的偽象中獨具優勢； (3)μ-XRF和XAS技術的聯合應用可深入認識生物與元素的相互作用，尤其是生物對元素的吸收、轉運、貯存和解毒機制，同時也能夠揭示典型環境樣品(如海洋鐵錳結核、土壤中磁性粒子和大氣顆粒物)中元素的來源、演化和歸趨等環境行為； (4)結合全反射X射線熒光的X射線吸收近邊結構譜技術能夠成功鑒定低濃度(μg·L-1級)的生物組織液中重金屬元素的形態。

雖然μ-XRF和XAS技術已廣泛用于生物與生態環境領域，但由于生態環境樣品基質的復雜性和多樣性，其仍存在一些技術難點與挑戰：

(1)μ-XRF掃描樣品中不同元素的分布時，存在X射線熒光的自吸收效應，尤其是對于輕元素。如比較一個含水的植物樣品(約0.1 mm厚)中Zn和P的分布，對Zn而言，基本能夠檢測到整個樣品深度的Zn熒光信號(0.1 mm深度處吸收了約7%的熒光信號)； 而對P而言，在樣品的較深處基本檢測不到P的熒光信號(0.1 mm深度處吸收了≥99%的熒光信號)[98]。

(2)XANES難以準確定量樣品中低豐度(5%～10%)的元素形態，同時其數據的線性擬合高度依賴于標樣，而生物和環境樣品的基質復雜，較難確定樣品中元素的配位基團，以致于難以準確地選定參與擬合的標樣，同時目前用于擬合的標樣有限，尤其是缺少含有特殊基團的生物標樣。因此，結合其他的元素形態分析技術(如非變性的色譜技術)和開發更多的標樣是實現準確的XAS形態分析的發展方向。

(3)目前，快速、短暫的氧化還原反應(活細胞中元素的氧化還原循環)還難以用XAS來研究，但X射線自由電子激光技術(XFEL)的發展可為研究這種快速的化學變化開辟新的研究領域，其飛秒脈沖的特征非常適用于生物活性金屬中心的時間分辨研究[99]。雖然XFEL技術的樣品破壞性限制了X射線信號的成像，但其可彌補同步輻射X射線光源無法實現的瞬變氧化還原反應中元素的形態鑒定[100]。