長柱型日本蛇根草花冠筒內(nèi)橫生絨毛作用探究

相孟達，嚴 潔，李 玉，鄧 偉，聶雪婷，湯曉辛

(1.貴州師范大學 西南喀斯特山地生物多樣性保護國家林業(yè)和草原局重點實驗室，貴州 貴陽550001；2.貴州師范大學 貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控實驗室，貴州 貴陽550001；3.貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽550001)

日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)，茜草科蛇根草屬植物，對生長環(huán)境要求較低，廣泛分布于廣西、貴州、云南等地[1]。通過超聲波提取技術(shù)、超臨界流體萃取等中藥提取新技術(shù)[2]，可有效地從中提取出喜樹堿等抗癌物質(zhì)[3]，具有較高的開發(fā)價值。探索影響日本蛇根草繁殖方式的因素，有利于合理開發(fā)該種植物。

野生植物的進化過程是不斷適應環(huán)境，完成生存繁衍的過程，被子植物長期進化過程中形成的花多樣性[4]，其不同的結(jié)構(gòu)與功能在對植物生殖過程不同階段產(chǎn)生不同程度的影響，被認為是被子植物進化成功的原因之一[5]。

某些植物在長期適應環(huán)境的過程中形成特殊花部結(jié)構(gòu)或附屬物[6-7]，通過特化的結(jié)構(gòu)提供新的機會[5]，從而提高繁殖成功率。一些植物會使用“傘”或表面疏水性結(jié)構(gòu)保護花粉不被打濕[8]。在武漢地區(qū)進行的植物花粉保護結(jié)構(gòu)對植物生殖影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，具有花粉保護結(jié)構(gòu)的植物通過隔離花粉與外部雨水影響花粉活力[9]；松香科植物花瓣上伴有附屬物，能分泌油脂，散發(fā)氣味吸引傳粉者[10]；眉蘭屬唇瓣形態(tài)與雌性泥蜂相似，具長紅毛，能分泌特殊氣味吸引雄蜂進行假交配而達到傳粉目的[11]；毛茛科植物二唇形花瓣使蜜腺隱藏更深，增加傳粉者取食難度，延長傳粉者的停留時間從而提高傳粉效率[12]。

在前期進行日本蛇根草傳粉實驗時，發(fā)現(xiàn)長柱型花筒內(nèi)具有橫生較長的白色絨毛覆于花藥上方，短柱花則無。對于這種附屬于花瓣的特殊結(jié)構(gòu)對植物生殖過程的影響，目前國內(nèi)外研究較少。為進一步探究該絨毛結(jié)構(gòu)在日本蛇根草繁殖過程中發(fā)揮的作用，我們進行了針對性的試驗。

1 試驗材料

1.1 研究物種與試驗地點

日本蛇根草是一種多年生草本植物，常生于常綠闊葉林下的溝谷沃土，花期冬春，花二型，花柱異長(圖1)。其中長柱型花筒內(nèi)部有一圈橫生且較長的白色絨毛，且絨毛恰好覆于雄蕊上方，而短柱型則無白色絨毛(圖2)。試驗時間為2020年1月，地點位于中國西南部施秉縣黑沖地區(qū)施秉云臺山(108°7′E，27°9′N)。

圖1 日本蛇根草不同柱型花朵A為長柱型，B為短柱型Fig.1 Flowers of different style types in O.japonica.A is long style type,B is short style type

圖2 日本蛇根草長柱型、短柱型花及結(jié)構(gòu)Fig.2 Long style and short style flowers of O.japonica and their structures注：A、B為長柱型；C、D為短柱型

2 試驗方法

2.1 前期處理

在實驗開始前選擇大量即將開放的長短柱型花苞，套袋后用掛牌做上標記，記錄日期等，以備后期各項實驗研究。

2.2 植物性狀測量

采用卷尺和游標卡尺測定了蛇根草兩種不同柱型的主要植物性狀，例如株高、葉片長寬、花筒深度、花筒直徑、花朵長寬、花朵開口長和寬、花瓣長和寬、雄蕊長度、雌蕊長度，花藥的長、寬、厚，柱頭的長、寬、厚等。測定樣本為60個(長柱型和短柱型各30個)。

2.3 不同柱型花朵對自然溫度變化響應

先將部分長柱型花筒中的長絨毛利用解剖針小心去除，做上標記，再將同區(qū)域未做處理的長柱型和短柱型做上標記(圖3)。然后利用熱成像儀(FLIR T650sc)連續(xù)5天于上午11～12時左右，分別對去除絨毛長柱型花、未處理長柱型花、短柱型花進行熱成像拍攝。拍攝得到的照片用FLIR Tools處理。

圖3 A為未處理長柱型，B為去除絨毛后長柱型Fig.3 A is the untreated long style type,B is the long style type after removing the pubescence

2.4 不同柱型繁育系統(tǒng)研究

2.4.1 花粉活力測定

采用TTC染色法進行花粉活力的測定[13]。(1)配制磷酸緩沖液：取0.78025 g的NaH2PO4·2H2O溶于50 ml雙蒸水中配成溶液甲；取1.791 g的Na2HPO4·12H2O溶于50 ml雙蒸水中配成溶液乙。取19.5 ml溶液甲和30.5 ml溶液乙混合即成。(2)不同濃度TTC溶液配制。0.1%TTC溶液：稱取0.01 g氯化四唑粉劑溶解于10 ml磷酸緩沖溶液，其他濃度TTC溶液均按此法根據(jù)不同比例配制。選用0.5%的TTC溶液對開放第一天至第六天的不同柱型的花粉進行染色。不同開放天數(shù)每種柱型均采取10～15個樣本，取下花藥，常溫下遮光染色12 h，并置于普通光學顯微鏡下觀察(染上紅色的花粉即為有活力花粉)，統(tǒng)計每個視野中紅色花粉比例，每個樣本統(tǒng)計5個視野。

2.4.2 柱頭可授性檢測

做花粉活力測定的同時，用鑷子取下柱頭，通過聯(lián)苯胺-過氧化氫法進行不同柱型的柱頭可授性檢測[14]。從之前標記的花苞中選取不同開放天數(shù)的花朵，從開放第一天至開放第六天的長短柱型花中均選取15～20朵，取下新鮮柱頭，置于載玻片，滴上一定量聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液，置于普通光學顯微鏡下觀察，有氣泡連續(xù)冒出，則視為柱頭有活性。

2.4.3 浸水不同時長花粉活力測定

采同開放時期的長短柱型花，取花藥，分別在蒸餾水中浸泡2 h、3 h、4 h，再分別用0.5%TTC溶液進行染色(樣本量及染色方法、統(tǒng)計方法與上文同)。

2.4.4 不同柱型自交親和性

2018年冬至2019年春，曾在同區(qū)域進行日本蛇根草的傳粉生物學實驗，對不同柱型的日本蛇根草進行過人工授粉，包括自然(除吊牌標記外，不做其他處理)，自交(用之前標記的套袋里的花做自交授粉處理，再將套袋套回，掛上吊牌)等。

2.5 數(shù)據(jù)分析

實驗中得到的數(shù)據(jù)均用IBM SPSS Statistics 22進行平均值和標準誤的差異性比較分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 植物性狀

如表1所示，長柱花和短柱花的花筒直徑呈顯著性差異，雄蕊長度、雌蕊長度呈顯著性差異，花藥長、寬、厚，柱頭長、寬、厚呈顯著性差異，其余各項植物性狀差異不顯著(表1)。

表1 日本蛇根草植物性狀Table 1 plant traits of O.japonica

3.2 不同柱型花冠筒區(qū)域溫度變化

連續(xù)5天在同區(qū)域同時段對長柱花朵、短柱花朵、去絨毛長柱花朵進行熱成像拍攝，同時對長柱花、短柱花、去除絨毛后長柱花的溫度進行了對比。結(jié)果表明，長柱花花筒區(qū)域溫度連續(xù)5天內(nèi)均高于去除絨毛后長柱花花筒區(qū)域溫度，且差異性顯著；長柱花與短柱花相比，在第3天，短柱型花筒區(qū)域溫度高于長柱型，差異顯著，第4天，短柱型稍高于長柱型，差異不顯著，其余時間則為長柱型高于短柱型且差異顯著(圖4)。

圖4 長短柱型及去絨毛長柱型花筒區(qū)域熱成像溫度變化圖(僅組內(nèi)比較分析)Fig.4 Thermal imaging temperature variation of long and short style and Long style with pubescence removed(intra group comparison analysis only)

3.3 兩種柱型花粉活力

研究結(jié)果表明，長柱型和短柱型花粉均在花朵開放第2天時活力最強，但無顯著性差異。長柱型從花朵開放第5天往后，花粉活力急劇下降，而短柱型則從第3天開始花粉活力就急劇下降。長柱型花粉活力整體趨勢高于短柱型，從第3天開始兩者花粉活力呈現(xiàn)顯著性差異(圖5)。

3.4 兩種柱型柱頭可授性變化

結(jié)果顯示，從開放第1天至第3天長短柱花的所有柱頭均具有可授性，但從第3天起，長短柱型的柱頭可授性均開始下降(圖6)。

3.5 浸水不同時長花粉活力變化

結(jié)果顯示，浸水2 h后長短柱型花粉活力相近，無顯著性差異；浸水3 h后，長柱型花粉活力仍較強，短柱花花粉活力則急劇下降，呈現(xiàn)顯著性差異；浸水4 h后，長短柱型花粉活力均較弱，下降至20%以下，呈現(xiàn)顯著性差異(圖7)。

3.6 兩種柱型不同授粉處理結(jié)果

根據(jù)日本蛇根草傳粉生物學試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在自然狀態(tài)下和人工控制進行自交情況下，長柱型的自然和自交處理所得種子數(shù)均顯著高于短柱型(圖8)。

圖5 長柱型、短柱型花粉活力變化Fig.5 Changes of pollen vitality of long and short style type

圖6 不同柱型日本蛇根草柱頭可授性變化Fig.6 Changes in stigma receptivity of O.japonica with different style types

圖7 不同柱型花粉浸水不同時長后花粉活力變化Fig.7 Changes of pollen viability of different style types pollen after soaking for different time

圖8 不同柱型日本蛇根草不同授粉處理種子數(shù)Fig.8 The number of seeds obtained by different pollination treatments with different style types

4 討論

植物特殊花部結(jié)構(gòu)會對植物生殖過程產(chǎn)生影響[10]。研究表明日本蛇根草花柱異長，長短柱兩種類型的花筒直徑，柱頭和花藥長、寬、厚有顯著性差異，長柱型花筒內(nèi)具白色絨毛，短柱型無，其余花部形態(tài)特征均無顯著性差異，能對日本蛇根草生殖過程產(chǎn)生影響的花部特征，可能為花柱長短和特殊絨毛的有無。

生長溫度對花粉活力產(chǎn)生較大的影響[15],生長在適溫下的花粉活力高[16-17]。這在進行花粉活力測定時得到證實，長柱型花粉活力總體較高，短柱型活力較低，而且長柱型的較高的花粉活力能維持相當一段時間。熱成像儀檢測溫度變化的實驗結(jié)果表明，長柱型的絨毛結(jié)構(gòu)具有保溫作用，結(jié)合試驗的時間是在1月份，溫度較低，這一結(jié)果也說明絨毛保溫作用對花粉的保護。

花粉浸水實驗顯示出長柱型花粉具有較強的耐水性，該現(xiàn)象似乎與前人研究中關(guān)于“具有保護結(jié)構(gòu)的花粉耐水性較弱”的結(jié)論相反[9]，然而這是可以解釋的，在成功授粉前許多因素會影響花粉命運[18]：首先是花粉的移出，長柱型花藥包裹在花筒中，一定程度上影響了花粉被傳粉者移出，降低了繁殖成功概率，因此長柱型耐水性較高可減小此結(jié)構(gòu)負面效應；其次是花粉的落置和花粉管的萌發(fā)，大多數(shù)的自交不親和機制不能防止植物的花粉落到自己的柱頭上[19]。有多項研究表明，自花粉在堵塞柱頭或以其他方式干擾異交花粉時，會對適應度產(chǎn)生負面影響[20-22]，植物防止自交的一種常見方式是在同一朵花中通過時間和空間分離花粉和柱頭[19]。在自交親和性實驗中長柱型自交親和性顯著高于短柱型。日本蛇根草開放第一天即具有較高的花粉活力和柱頭可授性，在時間上的分離不太明顯，而長柱型的絨毛結(jié)構(gòu)則在空間上實現(xiàn)了分離(圖5和圖6)，因此也可以看出長柱型抵消自交親和性高的負面效應的進化特征，短柱型無此結(jié)構(gòu)則花粉更容易落至自己柱頭(圖2)，所以短柱型具有自交親和性較低的進化特征。

試驗在驗證日本蛇根草(長柱型)絨毛結(jié)構(gòu)對其生殖方面影響的同時，也為探索花部特征進化的動力提供了一些證據(jù)?；ú刻卣鞯乃茉煊缮锖头巧镆蛩毓餐瓿?，在前人進行的研究中認為傳粉者介導的選擇，推動了花部特征多樣化和相關(guān)特征共同進化[23-28]，特化的植物中，這種作用表現(xiàn)的更加明顯。但傳粉者介導的特征選擇不能解釋所有的花部特征分化[29]，植物對一些非生物因素的適應，如干旱[30]、溫度[31]、水[32]等，同樣介導了花部特征的分化。而花部特征的分化，特別是一些較為特殊的花部結(jié)構(gòu)，又通過在植物生殖過程的不同階段或不同方面發(fā)揮作用，影響植物的繁殖以及演化方向。從試驗結(jié)果看，長柱型日本蛇根草的絨毛結(jié)構(gòu)具保溫作用，從而影響植物花粉活力，使長柱型蛇根草的花粉活力高于短柱型；長柱型花粉的耐水性強于短柱型；而且其自然、自交的繁殖成功率也顯著高于短柱型。這些證據(jù)不僅有助于植物繁殖與進化的研究，也為日本蛇根草的保護與開發(fā)提供了重要的理論參考。