紫花前胡的提取工藝優化研究

馬思楠， 李 欠*，陳玉瑩，馮彥梅，余 萍

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070； 2.甘肅農業大學 農學院，甘肅 蘭州730070； 3.甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室，甘肅 蘭州730070)

中藥紫花前胡是傘形科當歸屬植物紫花前胡Peucedanumdecursivum(Miq.) Maxim 的干燥根[1]。紫花前胡為常用中藥，具有降氣化痰，疏散風熱的功效，用于治療風熱咳嗽痰多等癥[1-2]。現代藥理學研究表明，紫花前胡中主要活性成分是香豆素類化合物，其具有抗神經衰弱、抗凝血、抗氧化、抗菌、抗癌等多方面的藥理活性[3-4]，在藥物研發和臨床應用中具有廣泛應用價值。

中藥成分復雜，采用單一指標成分來控制單味藥材的質量，具有一定的片面和局限性[5]。因此多指標定量分析受到人們廣泛的關注,而中藥多指標分析的前提是中藥多組分的提取，所以優選適合中藥多指標成分的提取工藝參數是關鍵所在。近年來，響應面法已廣泛應用于優化中藥提取工藝的研究[6-9]，具有試驗次數相對較少、檢測精確度高、預測的函數模型精準的優點[10-11]。目前對紫花前胡藥材研究多集中在單指標成分含量測定，多指標成分含量研究較少[12]。為此，以紫花前胡為研究對象，以香豆素類成分紫花前胡苷、傘形花內酯、花椒毒素、補骨脂素和佛手柑內酯為考察指標進行綜合評分，結合響應面法，優化紫花前胡的提取工藝，對進一步提升紫花前胡資源的開發和利用具有重大意義。

1 儀器與試劑

1.1 試驗儀器

Waters 高效液相色譜儀(上海市沃特世科技有限公司)；KQ-500B超聲波清洗儀(深圳市得康科技有限公司)；JFSD-100粉碎機(浙江省永康市金穗機械制造廠)；AL-104電子分析天平(慈溪市天東衡器廠)；T6 新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 試驗材料

對照品傘形花內酯(批號18010202)、紫花前胡苷(批號18030702)、補骨脂素(批號19101703)、花椒毒素(批號17111503)、佛手柑內酯(批號17120501)均購于成都普菲德生物技術有限公司，純度≥98%；乙腈、甲醇(色譜純，均購于國藥集團化學試劑有限公司)；紫花前胡藥材采購于甘肅黃河藥材市場經甘肅農業大學中藥學教研室陳垣教授鑒定為中藥紫花前胡。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

取傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素和佛手柑內酯對照品適量，精密稱定，分別置于5 mL容量瓶內，加甲醇溶解并稀釋即得對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液0.5 mL置于10 mL容量瓶內，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為42、41、41、86、56 μg·mL-1的混合對照品溶液，用時加甲醇溶液稀釋，得到含有不同質量濃度的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取紫花前胡藥材粉末(過三號篩)1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加甲醇25 mL，浸漬1 h后超聲(功率250 W、頻率50 KHz)提取20 min，取出，冷卻補重，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。進樣前用0.45 μL微孔濾膜濾過。

2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，20%～25% B；2～18 min，25%～40%B；18～28 min，40%～50%B；28～31 min，50%～65%B；31～45 min，20%B)；檢測波長：259 nm，325 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。在上述條件下傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯的分離度良好，混合對照品及紫花前胡樣品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A),(B)和紫花前胡樣品(C),(D)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed references(A),(B)and sample (C),(D) 注：1-傘形花內酯；2-紫花前胡苷；3-補骨脂素；4-花椒毒素；5-佛手柑內酯

2.3 高效液相色譜法方法學考察

2.3.1 線性關系考察

將上述不同質量濃度的混合對照品按照“2.2”項依次進樣，測定并記錄各色譜峰峰面積。以溶液質量濃度為橫坐標(X)，對應峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。

2.3.2 精密度試驗

取“2.1.1”項下對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下，連續進樣6次，記錄峰面積，分別計算5種香豆素類物質的Relative standard deviation(RSD)值。

2.3.3 穩定性試驗

取紫花前胡樣品6份，按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進樣測定，記錄峰面積，分別計算5種香豆素類物質的RSD值。

2.3.4 重復性試驗

平行制備6份供試品溶液，在同一試驗條件下測定，記錄峰面積，分別計算5種香豆素類物質的RSD值。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的紫花前胡樣品1 g，平行6份，分別加入一定量的各對照品儲備液，按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，進樣，測定峰面積，計算平均加樣回收率。

2.4 樣品含量測定

精密稱量單因素及響應曲面試驗樣品，按“2.1.2”項方法制備溶液，“2.2”項色譜條件進樣測定，平行制備3份，得到樣品含量平均值。

2.5 數據標準化處理

將單因素試驗和響應面試驗的結果進行Z-score 標準化處理[9,13-14]，得到5種指標成分的綜合評分。

2.6 單因素試驗設計

以5種香豆素類成分含量的綜合評分值為考察指標，分別考察液料比、甲醇濃度和超聲時間對提取率的影響。試驗設計方案見表1。

表1 單因素試驗條件Table 1 Design of single factor tests

2.7 響應面試驗設計方案

以上述優化后的各單因素值為基礎，通過Design-Expert 8.0.6 Trial軟件Box-Behnken響應面設計，對液料比、甲醇濃度、超聲時間3個因素結果進一步優化，重復試驗，并進行分析。

3 結果與分析

3.1 方法學考察結果

3.1.1 線性關系考察

分別以對照品的峰面積(X)與對照品溶液濃度(Y)做線性回歸，得到傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素和佛手柑內酯的回歸方程及線性范圍分別為：

Y=19285X+6074.9，R2=0.999 8，線性范圍0.07～42.00 μg·mL-1；

Y=38779X+10295，R2=0.999 8，線性范圍0.06～41.00 μg·mL-1；

Y=25689X+6779.5，R2=0.999 8，線性范圍0.07～41.00 μg·mL-1L；

Y=41421X+28717，R2=0.999 8，線性范圍0.14～86.00 μg·mL-1；

Y=24865X-559.34，R2=0.999 9，線性范圍0.09～56.00 μg·mL-1。

3.1.2 精密度試驗

以峰面積計算得到傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯的RSD分別為0.96%、0.62%、1.08%、0.86%、0.84%，表明該條件下儀器的精密度良好。

3.1.3 穩定性試驗

以峰面積計算得到傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯的RSD分別為0.82%、0.15%、0.86%、0.45%、0.86%，表明該供試品溶液在12 h內穩定性良好。

3.1.4 重復性試驗

以峰面積計算得到傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內酯的RSD分別為0.28%、0.61%、1.56%、0.45%、0.86%，表明該方法重復性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗

傘形花內酯，紫花前胡苷，補骨脂素，花椒毒素和佛手柑內酯平均回收率分別為101.31%、105.27%、90.85%、106.42%、90.19% ，RSD分別為2.07%、3.17%、1.62%、2.53%、4.54%，結果顯示加樣回收率良好。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 料液比對綜合評分的影響

根據單因素試驗設計(表1)進行實驗，考察結果采用Z-score標準化處理數據(表2)。當液料比增加時，有利于有效成分擴散，從而增大提取極限[15]。隨著液料比增加，有效成分獲得足夠的擴散空間，提取率達到最佳且基本穩定。考慮到液料比會對溶液的酸堿度產生影響，使紫花前胡中某些香豆素苷類成分結構發生變化，因此液料比35 mL·g-1作為最優選擇。

3.2.2 甲醇濃度對綜合評分的影響

根據單因素試驗設計(表1)進行，考察結果采用Z-score標準化處理數據(表2)。隨著甲醇濃度的增加，有利于有效成分脫離固體表面溶解到溶劑主體中，增大溶出率[16]，當甲醇濃度達到80%時，五種香豆素類成分總的提取率達到最高，甲醇濃度高于80%，提取率緩慢降低。由于甲醇是中性溶劑且藥材成分復雜，對于有效成分的溶解有一定的限制，若甲醇和水按照一定比例溶解，會加速藥材中親脂和親水性成分的溶出，所以選擇甲醇濃度80%為最佳提取濃度。

3.2.3 超聲時間對綜合評分的影響

根據單因素實驗設計(表1)進行實驗，考察結果采用Z-score標準化處理數據(表2)。利用超聲提取的機械作用、空化作用和熱效應，增大溶劑的擴散、浸透和溶解[16]，當超聲時間在20～40 min時，綜合評分逐漸增大，在40～50 min時，綜合評分緩慢減小。推測出有效成分隨著超聲時間的增加，紫花前胡中有效成分逐漸溶出，當到達一定時間后，提取時間的增加會破壞有效成分的析出，因此，選擇40 min作為最佳超聲時間。

表2 單因素試驗結果Table 2 Results of single factor tests

3.3 響應面試驗結果

3.3.1 響應面試驗設計方案

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken響應面法設計原理，設計17個試驗點(5個零點)的三因素三水平的響應面分析試驗，以料液比(A)、甲醇濃度(B)、超聲時間(C)為自變量，5種香豆素類成分含量的綜合評分作為響應值，進行Box-Behnken試驗設計(表3)。

3.3.2 模型顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對二次多項式回歸方程進行擬合，得二次多元回歸方程：

R=7.72+1.66A+0.36 B+1.32 C+0.17 AB+0.94AC-0.17BC-7.59A2-5.07 B2-2.16 C2

由表4的方差分析結果可知，該擬合模型具有極顯著(P<0.001)失擬項不顯著(P=0.2605)。由F值可以看出，所選的各因素水平范圍內，對成分提取的影響大小為液料比(A)>超聲時間(C)>甲醇濃度(B)。

3.3.3 最佳提取工藝優化與參數預測結果

以5種香豆素類成分含量最大值為目標，運用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件繪制三維響應面圖(圖2)并進行預測分析。以各組分綜合評分值為評價指標優選紫花前胡最佳提取工藝參數為液料比33.69 mL·g-1，甲醇濃度80.32%，超聲時間46.64 min。在此條件下，5種香豆素類成分提取綜合評分為5.940 1。

表3 響應面實驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken test

表4 回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for regression model

3.4 驗證試驗結果分析

根據最佳提取工藝條件進行驗證試驗，同時考慮到實際操作的可行性，將工藝參數調整為，液料比34 mL·g-1，甲醇濃度80%，超聲時間47 min，重復3次，結果見表5。對結果的均值進行標準化處理后，得綜合評分為6.073 4，與預測值5.940 1相比，驗證值與預測值偏差為2.28%，模型預測性好，說明優化后的提取工藝可靠，穩定，具有實際應用價值。將《中國藥典》2015年版中所使用的含量測定方法制備供試品溶液，與驗證試驗結果進行比較。根據藥典中規定的紫花前胡苷含量為單一評價指標，優化的提取工藝比藥典法高；傘形花內酯含量也明顯高于藥典法，而其它3種香豆素類成分含量無明顯變化。因此，基于多指標綜合評分法建立的提取工藝參數，其重復性好，操作性強，具有實際應用價值。

圖2 紫花前胡提取工藝優化響應面圖Fig.2 Optimized response surface map of extraction process of P. decursivum

表5 工藝驗證結果

4 討論

中藥紫花前胡的研究主要集中在化學成分分離分析和單一成分的藥理作用，對于多指標成分含量研究還相對較少。香豆素類是紫花前胡中含量相對較多且生物活性較強的一類化合物[17-19]，具有多種藥理活性，是廣泛分布于植物界中的次生代謝產物[3]。因此，研究紫花前胡中香豆素類化合物具有重大意義。

目前藥典中紫花前胡藥材質量控制僅以紫花前胡苷單指標性成分作為評價指標[1]，而中藥成分復雜，單一成分難以綜合評價藥材質量，無法保證中藥臨床藥效。因此，為了更好的發揮其藥用價值，對其化學成分的提取工藝進行優化。提取工藝主要以提取含量作為評價指標，而高效液相色譜法測定藥材成分的含量會更加準確和可靠，故本實驗選擇HPLC法檢測5種香豆素類成分即傘形花內酯、紫花前胡苷、補骨脂素、花椒毒素和佛手柑內酯的含量，以這5種香豆素類成分的總提取量為指標進行單因素考察，通過單因素試驗選擇合適的3因素3水平，以料液比、甲醇濃度和超聲時間進行考察，為避免5種成分質量分數差異太大造成低含量成分的影響被掩蓋的問題而影響實驗結果的準確性，將5種香豆素類成分的含量用Z-score標準化處理得到綜合評分作為響應值，再通過Box-Behnken響應面法進行擬合，得到最佳的提取工藝條件，為進一步研究紫花前胡有效成分開發利用提供參考價值。