當歸咖啡酸-O-甲基轉移酶基因的克隆與表達分析

張 培，侯云龍，蘇 敏，孫 利，徐登封，宋 濤，周璐恒，趙韶華*

(1.承德醫學院 中藥研究所，河北 承德 067000； 2．石家莊市第二醫院，河北 石家莊 050051；3．石家莊以嶺藥業股份有限公司，河北 石家莊 050035)

當歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)是傘形科多年生草本植物，其干燥的貯藏根是我國傳統的大宗藥材之一[1]，具有悠久的藥用歷史，在方劑中的應用甚廣，具有平喘、保肝、抗胃腸功能障礙，促進造血等藥理作用[2-4]。阿魏酸是當歸的主要藥效成分之一，毒副作用小，其衍生物常用于抗癌藥物、食品、化妝品等原料[5]。阿魏酸又是當歸的代謝產物，主要生物合成途徑之一是咖啡酸甲基轉移酶途徑[6]，這個反應由苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸生成反式-肉桂酸開始，再由肉桂酸-4-羥基化酶催化反式-肉桂酸生成對-香豆酸，經香豆酸-3-羥基化酶催化作用生成咖啡酸，并以甲硫氨酸作為甲基供體，在咖啡酸-O-甲基轉移酶(Caffeic acid o-methyltransferase，COMT)的催化作用下生成阿魏酸[7]。其中，COMT作為一種重要的甲基化酶，可催化咖啡酸生成阿魏酸，且COMT的基因表達和酶活性的改變會直接或間接影響木質素類、苯酞類、香豆素類、黃酮類、有機酸類等代謝產物的生成[8]。因此，COMT可能在促進當歸的生長發育及適應環境和阿魏酸的合成過程中起著關鍵作用。

通過大腸桿菌原核表達系統合成異源蛋白，可以方便研究植物中目標蛋白的生物學功能和酶學特性[9]。原核表達系統具有產量高、易操作和廉價等優點[10]，為研究當歸AsCOMT蛋白的表達提供了有效工具。無縫克隆作為一種新興的DNA克隆技術能快速實現片段與片段或片段與載體的無縫連接，不受酶切位點的限制，也不需要單獨的連接反應，可廣泛應用在多片段重組和重組表達載體的構建中[11]。雒軍等[12]利用同源克隆法及RACE技術從當歸中克隆出AsCOMT基因的cDNA全長，并通過生物信息學的方法對該序列進行分析。吳曉剛等[13]從馬尾松中克隆出PmCOMT基因的cDNA全長，并通過實時熒光定量PCR分析該基因在不同組織的表達量。劉裕峰等[14]不僅克隆了板栗CmCOMT基因全長cDNA，分析其編碼蛋白的生物學信息，而且對該基因進行了原核表達，為獲得大量的CmCOMT蛋白，進一步對誘導表達條件進行優化。目前僅是從當歸中克隆得到COMT基因，但尚未進行組織特異性及原核表達分析。傳統的載體構建方法受限制性內切酶、載體和目的片段的限制，不僅工作量大、操作繁瑣，重組效率也較低。無縫克隆技術能解決上述難題，但是目前利用該技術構建重組載體的報道還較少。本研究以當歸葉片為材料采用PCR技術克隆當歸的COMT基因，利用無縫克隆技術將當歸COMT基因的ORF序列插入pGEX-4T-3載體來構建重組表達載體，熱擊法轉化大腸桿菌并利用IPTG誘導重組蛋白表達，進一步優化誘導表達條件以獲得可溶性的重組蛋白，為后續當歸COMT蛋白的分離與純化提供技術支持。

1 儀器與試劑

1.1 植物材料

當歸植株來自甘肅岷縣實驗基地。利用Trizol法[15](Invitrogen)提取當歸不同組織(根、葉柄及葉片)的總RNA，-80℃保存備用。采用PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存備用。

1.2 菌株與質粒

pGEX-4T-3表達載體含谷胱甘肽S轉移酶(Glutathione-S-transferase,GST)和pMD 19克隆載體均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；大腸桿菌感受態細胞DH5α和BL21(DE3)菌株均購自北京全式金生物有限公司。

1.3 實驗試劑

EcoR Ⅰ酶、In-Fusion?HD Cloning Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、Premix Ex Taq、DL2000 DNA Marker、質粒DNA小提試劑盒及DNA膠回收與純化試劑盒均購于寶日醫生物技術(北京)有限公司；GoTaq?Real-Time PCR Systems試劑盒購于普洛麥格(北京)生物技術有限公司；氯霉素購于青島生工生物科技有限公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖(Isopropyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、氨芐青霉素、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 儀器與設備

電泳系統(DYY-5，北京六一儀器廠)，多功能成像系統(Azure Biosystems Inc C300，美國)，冷凍離心機(Thermo Micro 21R，美國Thermo公司)，恒溫水浴鍋(HH-4，常州澳華儀器有限公司)，電子天平(梅特勒PL602E，瑞士)，PCR儀(Bio-Rad icycler IQ，美國)，B2級生物安全柜(HFsafe-1200 B2，上海)，氣浴恒溫搖床(GFL 3033，德國)，全波長酶標儀(Bio-Rad Bench mark plus)，實時熒光定量PCR儀(楓嶺FTC-3000P，加拿大)，超聲波細胞粉碎機(寧波新芝)。

2 實驗方法

2.1 當歸COMT基因克隆

根據已知的當歸COMT基因的序列設計特異性引物S和A，以前期研究所得當歸葉片總cDNA為模板，利用PCR技術擴增當歸COMT基因的cDNA全長。PCR反應條件為95℃3 min；95℃1 min，56℃45 s，72℃1 min，30個循環；72℃延伸8 min，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的條帶。將其連接到pMD19-T載體上進行TA克隆，熱擊法轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，經菌落PCR鑒定后挑選陽性單克隆進行測序。所用引物見表1。

2.2 當歸COMT基因的生物信息學分析

使用NCBI ORF Finder查找該基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)；采用NCBI數據庫中的Blast，將AsCOMT基因編碼的氨基酸序列在GenBank中進行同源性搜索；利用DNAMAN軟件對不同來源的COMT氨基酸序列進行多重比對；用ExPASy提供的Protparam tool預測AsCOMT基因編碼蛋白的理化性質；利用NCBI的Conserved domains預測AsCOMT蛋白的保守結構域；通過Protscale (http://web.expasy.org/protscale/)預測蛋白質的疏水性；使用SignalP 4.1進行信號肽的預測；通過TMHMM Server v.2.0預測蛋白跨膜區。

表1 當歸AsCOMT基因擴增所用引物Table 1 Primers for amplification of AsCOMT gene in A.sinensis

2.3 AsCOMT基因熒光定量PCR分析

當歸各組織的cDNA稀釋10倍作為Real-time PCR反應模板。以GAPDH為內參基因，采用GoTaq?qPCR試劑盒進行實時熒光定量PCR分析。反應體系：2×qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL，無RNase水7.4 μL。擴增程序：95℃預變性3 min，95℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s進行40個循環，每個組織樣品設置1次生物學重復，每個樣品重復3次。根據溶解曲線判斷Real-time PCR產物的特異性，相對定量分析采用2方法，所得試驗數據用統計分析軟件SPSS 21 進行單樣本T檢驗，并使用Graph Pad Prism軟件繪圖。

2.4 原核表達載體的構建

2.4.1 基于無縫克隆技術的PCR引物設計

無縫克隆技術的原理是在目的基因PCR引物的5'端加上與線性化載體同源的15 bp堿基序列，無縫克隆酶能特異性識別目的基因PCR產物和線性化載體兩端的同源序列，并發生同源重組。通過PCR和20～30 min的同源重組反應就能將目的基因片段克隆到目標載體上。據PCR引物設計原則利用Primer Premier 5 軟件參照AsCOMT基因片段序列設計一對引物F和R(見表1)。其中斜體為EcoR Ⅰ酶切位點，下劃線為依據AsCOMT基因的ORF序列設計的引物，酶切位點前15 bp為線性化pGEX-4T-3載體粘性末端的同源序列。

2.4.2 目的基因片段擴增

以pMD 19-AsCOMT質粒為模板，使用引物F和R擴增當歸COMT基因片段，PCR反應體系：2×Premix Taq 10 μL，模板1 μL，正反向引物(10 μM)各0.5 μL，無酶水 8 μL。反應條件: 94℃ 預變性 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 10 min。PCR產物經電泳檢測后回收純化目的基因片段。

2.4.3 表達載體pGEX-4T-3線性化

用EcoR Ⅰ單酶切pGEX-4T-3載體。反應體系：EcoR Ⅰ 1 μL，10×H Buffer 2 μL，質粒DNA 1 μg，滅菌水補足至20 μL。37℃酶切1 h，65℃滅活10 min。酶切后并回收純化。

2.4.4 重組表達載體的構建及驗證

pGEX-4T-3質粒經EcoR Ⅰ單酶切后并回收純化。采取In-Fusion?HD Cloning Kit建立當歸COMT基因片段與線性化pGEX-4T-3載體的同源重組反應。反應體系：質粒酶切產物1 μL，目的片段1 μL，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，無酶水 12 μL。37℃反應30 min，立即至冰水浴中冷卻5 min。繼續使用熱擊法轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中。篩選陽性單克隆，經菌落PCR驗證后進行測序。確定目的基因序列與質粒組裝無誤后，將重組后的原核表達載體命名為pGEX-4T-3-AsCOMT。

2.5 IPTG誘導表達條件優化

將轉化成功的重組菌株接種在含80 μg/mL氨芐青霉素和35 μg/mL氯霉素的LB液體培養基中，37℃，220 r/min振蕩培養過夜。次日按1:100的接種量進行亞培養，至菌液OD600約為0.6時分別進行不同條件的誘導。

2.5.1 IPTG濃度的篩選

分別加入不同濃度的IPTG，使IPTG終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L，25℃，160 r/min下誘導表達8 h后取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。同時以轉化pGEX-4T-3空載體的E.coliBL21(DE3)和未誘導的重組菌為對照。

2.5.2 誘導時間的篩選

加入IPTG使終濃度為1.0 mmol/L，25℃，160 r/min下誘導表達，分別在2 h、4 h、6 h、8 h取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。同時以空載菌和未誘導的重組菌為對照。

2.5.3 培養溫度的篩選

加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，分別在16℃、20℃、25℃、30℃(轉速均為160 r/min)下誘導表達，8 h后取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。

2.5.4 表達蛋白的可溶性檢測

為確定重組蛋白誘導表達的最適溫度，同時評估在不同溫度下誘導的目的蛋白的可溶性，分別以20℃、25℃和30℃誘導8 h后收集的菌液，4℃，5 000 r/min離心20 min收集菌體并用1×PBS緩沖液洗滌沉淀，重懸。取5 mL菌液于冰浴中超聲破碎菌體至完全，以4℃，10 000 r/min離心10 min分離上清和沉淀。分別向樣品中加入100 μL ddH2O和100 μL 2×SDS上樣緩沖液，沸水煮7 min，冷卻后取15 μL樣品進行10% SDS-PAGE檢測。

3 結果與分析

3.1 當歸COMT基因的克隆

當歸COMT基因的PCR產物約為1 100 bp(如圖1)，且AsCOMT基因的陽性單克隆的測序結果與已知序列(Accession number：KP188587)一致。經NCBI ORF Finder檢測發現該序列包含一個完整的ORF，大小為1 098 bp，編碼365個氨基酸。

圖1 PCR擴增AsCOMT基因Fig.1 PCR amplification of AsCOMT geneM為DNA Marker；1～3為PCR產物

3.2 AsCOMT基因編碼蛋白的生物信息學分析

當歸COMT基因編碼的氨基酸序列與其他植物COMT氨基酸序列具有較高的同源性。且多重比對分析發現當歸COMT位于224～354氨基酸序列具有植物S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)高度保守的功能域(見圖3)，包括VVDVGGGTG、GINFDLPHV、EHVGGDMF、NGKVI及GGKERT[14]，進一步說明AsCOMT屬于COMT蛋白家族成員之一。

表2 當歸COMT基因編碼蛋白的生物信息學分析Table 2 Bioinformatics analysis of the protein encoded by AsCOMT gene

表3 不同植物COMT氨基酸的同源性比對Table 3 Homology comparison of amino acids of COMT in different plants

3.3 AsCOMT基因的組織特異性分析

AsCOMT基因的擴增曲線斜率一致且趨勢正常，基線平整；熔解曲線峰值單一，引物特異性較好，未產生非特異性擴增。Real-time PCR結果顯示，AsCOMT基因在當歸各組織中均有表達，而且根中表達量最高，其次是葉片，葉柄中最低，說明AsCOMT基因在當歸中的表達具有組織特異性，以在根中表達為主。

圖2 AsCOMT蛋白保守域分析Fig.2 The conserved domains of AsCOMT protein

圖3 AsCOMT與其它植物COMT蛋白的多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of AsCOMT and COMT proteins from other plant species注：紅色方框所示即為結合位點

圖4 當歸不同組織總RNA的提取Fig.4 Total RNA extraction from different tissues of A.sinensis注：M為DNA相對分子量標準；1，2為葉柄；3，4為葉片；5，6為根

圖5 AsCOMT基因在當歸不同組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression level of AsCOMT gene in different tissues of A.sinensis*表示差異有統計學意義(P<0.05)，與葉柄相比

3.4 原核表達載體的構建及鑒定

重組質粒的菌落PCR產物約為1 128 bp(圖6)，與預期結果一致；且重組質粒陽性單克隆的測序結果與當歸AsCOMT基因cDNA序列比對結果一致，表明pGEX-4T-3-AsCOMT表達載體構建成功。

圖6 陽性單克隆的菌落PCR鑒定Fig.6 Detection of pGEX-4T-3-AsCOMT-Ecoli.BL21 (DE3) by colony PCR注：M為DNA Marker；1～3為PCR產物

3.5 IPTG不同濃度對誘導重組蛋白表達的影響

3.5.1 IPTG濃度對重組蛋白表達的影響

由圖7可知，含有空載體的大腸桿菌和未誘導重組菌中均未出現與目的蛋白大小相當的條帶。但在不同IPTG濃度誘導的重組菌中(泳道3～6)均檢測到分子量約為66 kDa的蛋白條帶。AsCOMT基因編碼的蛋白預測相對分子質量為40.230 kDa，而當pGEX-4T-3質粒在大腸桿菌中表達時，重組蛋白的N-末端融合了pGEX-4T-3載體的谷胱甘肽轉移酶GST標簽(26 kDa)，總相對分子質量為66.230 kDa，所以在SDS-PAGE結果中約66 kDa處出現目的蛋白條帶，與預測的AsCOMT重組蛋白分子量相符。含空載體的菌株誘導后與未經IPTG誘導的重組菌均未出現目的條帶，而其他4條泳道均有大小與目標蛋白一致的蛋白條帶，且表達的蛋白量高于未經誘導的菌株。進一步驗證了AsCOMT基因能夠在大腸桿菌中與GST標簽進行融合并表達，且受ITPG的誘導。結果表明，AsCOMT重組蛋白成功在大腸桿菌BL21(DE3)中表達。當IPTG終濃度達到1.0 mmol/L時AsCOMT重組蛋白的表達量最大，并以此作為最適ITPG濃度。

3.5.2 誘導時間對重組蛋白表達的影響

由圖8可知，不同誘導時間1～4組均能表達目的蛋白，且隨著時間的延長，目的蛋白的量也在逐漸增加，以誘導8 h目的蛋白表達量最大，因此，以誘導8 h為最佳時間。

圖8 誘導時間對AsCOMT重組蛋白表達的影響Fig.8 Effect of induction time on the expression of AsCOMT recombinant protein注：M為蛋白質分子量標準；1為8 h；2為6 h；3為4 h；4為2 h；5為未誘導pGEX-4T-3-AsCOMT重組菌；6為pGEX-4T-3空載菌

3.5.3 溫度對重組蛋白表達的影響

由圖9可知，在不同溫度條件下均能誘導出目的蛋白，且隨著溫度的上升，目的蛋白表達量有所增加，在30℃達到最大。

圖9 溫度對AsCOMT重組蛋白表達的影響Fig.9 Effect of temperature on the expression of AsCOMT recombinant protein注：M為蛋白質分子量標準；1為16℃；2為20℃；3為25℃；4為30℃

3.5.4 重組蛋白的可溶性檢測

由圖10可知，3種溫度條件下均能誘導出目的蛋白，在25℃條件下主要以可溶的形式存在，且該條件下重組蛋白的表達量較20℃條件下高；在30℃條件下重組蛋白的表達量最大，但多以包涵體的形式存在于沉淀中，雜蛋白也較多，因此，目的蛋白誘導表達的溫度以25℃為宜，以獲得更多的可溶性蛋白。

圖10 AsCOMT重組蛋白的可溶性檢測Fig.10 Solubility detection of AsCOMT recombinant protein注：M為蛋白質分子量標準；1為沉淀-20℃；2為上清-20℃；3為沉淀-25℃；4為上清-25℃；5為沉淀-30℃；6為上清-30℃

4 討論

阿魏酸是一種植物來源的酚酸，在細胞壁中與多糖和蛋白質結合成為細胞壁的骨架[16]。阿魏酸具有廣泛的藥理學作用，如抗血栓、抗氧化[17]、抗炎、抗病毒、抗腫瘤[18]、神經保護[19-20]及保護肝腎作用[21]等，是當歸的有效成分之一，常作為藥材質量的控制指標[22]。在高等植物體內，阿魏酸是木質素生物合成過程的重要中間代謝產物之一，其生物合成涉及到許多酶的參與。COMT是植物體內調控木質素合成的關鍵酶之一[23]，它主要參與S-木質素的合成，并且可以對咖啡酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇甲基化分別生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇起到催化作用[24]。此外，過表達COMT植物木質素含量增加，且木質素組成改變，從而提高物種在干旱脅迫的適應能力[25]，如在番茄中過表達COMT提高了干旱脅迫下番茄植株的光合作用和抗氧化能力[26-27]。所以后續可利用RNAi或過量表達等方法研究AsCOMT基因表達特征及其分子作用，不僅有助于理解當歸特殊生境下的分子生理機制，而且通過遺傳工程手段進行改良，有希望提高當歸中木質素及其他苯丙酸途徑衍生物的含量，進一步培育高阿魏酸含量的當歸新品種，具有重要的商業價值和現實意義。

本研究采用RT-PCR的方法從當歸葉片中擴增獲得了1個長度為1 098 bp的AsCOMT基因的ORF序列，推測該基因編碼365個氨基酸，蛋白分子量約為40.23 kD，等電點為5.43。該蛋白含有SAM結合位點，進一步說明AsCOMT屬于COMT蛋白家族成員。通過DNAMAN軟件分析，發現該基因編碼的氨基酸序列與前胡Peucedanumpraeruptorum、峨參Anthriscussylvestris、川芎Ligusticumsinense、羅勒Ocimumbasilicum、茶樹Camelliasinensis等的COMT氨基酸序列的一致性達85%以上，表明COMT基因在進化過程中具有一定的保守性。相關研究顯示，COMT基因是一種古老的基因，它與植物進化過程基本一致[28]，并且在植物的進化過程中具有較高的保守性[29]，本研究的結果與此相同。

近年來，利用高通量測序技術對傳統藥用植物轉錄組的研究已經成為現代研究的重點，RNA-seq技術的發展極大的推動了轉錄組學的研究[30-31]，現已廣泛應用于藥學、生物學等領域。目前，已有多種藥用植物進行了轉錄組的研究，并開展了活性成分合成途徑關鍵酶基因的挖掘與分析[32]，為解析這些基因的功能奠定了基礎。因此，本研究今后將基于高通量轉錄組測序技術，利用生物信息學的方法，同時克隆當歸COMT基因家族中的其他成員，對當歸COMT基因及其編碼蛋白的結構與功能進行預測，并分析每個成員的功能以及各成員之間有無協同作用等，為深入解析當歸COMT基因家族成員的功能及木質素的合成途徑提供參考。

實時熒光定量PCR結果顯示AsCOMT基因在當歸不同組織的相對表達量為根>葉片>葉柄。這種表達模式可能與當歸以根入藥有關，膨大的根中積累較多的阿魏酸、藁苯內酯、有機酸類等成分[33]，而在葉片中積累較少，這些結果說明AsCOMT基因可能在阿魏酸、苯酞類化合物的合成過程中起關鍵作用[34]。

原核表達系統的優越性體現在產量高、易操作、穩定性好、成本低等[35]，通過在大腸桿菌中表達當歸AsCOMT蛋白，為研究AsCOMT蛋白的酶學活性提供了一條有效的途徑。傳統的載體構建方法需要設計滿足特殊條件的引物并通過多種操作程序來實現。與傳統的構建方法相比，無縫克隆是一種快捷高效的克隆技術，在不依靠限制性內切酶、連接酶的情況下能將帶有15 bp同源序列的目的基因片段無縫克隆到目標載體上，適用于多種載體的構建，也可完成多片段連接和定點突變試驗等[11]。本研究用無縫克隆方法成功構建了pGEX-4T-3-AsCOMT重組質粒，轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過IPTG誘導重組蛋白表達，得到分子量約66 kDa的目的蛋白，與GST標簽和AsCOMT蛋白兩者融合產生的蛋白分子量一致。為獲得大量的AsCOMT蛋白進一步優化表達條件，研究發現在IPTG濃度為1.0 mmol/L，25℃條件下誘導8 h獲得的目的蛋白表達量較多，且重組蛋白主要以可溶的形式存在；在30℃誘導表達時，重組蛋白表達量最多，但多呈包涵體的形式，說明較低的誘導溫度有利于重組蛋白的折疊并形成正確的立體結構，而較高溫度下重組蛋白則多以包涵體的形式存在[36-37]。后期將通過Ni2+親和色譜獲得了純化的AsCOMT重組蛋白，為下一步進行體外酶促反應，研究AsCOMT酶學活性以及底物特異性奠定基礎，將有助于深入認識當歸阿魏酸生物合成途徑及其調控機制，為研究AsCOMT基因在當歸阿魏酸生物合成中的功能奠定基礎，也為通過基因工程技術遺傳改良當歸提供候選基因。

COMT作為阿魏酸生物合成途徑的關鍵酶之一，對阿魏酸的合成起重要的調節作用，是從分子水平上揭示當歸阿魏酸生物合成機理的一個創新點。本文為后期當歸AsCOMT蛋白的分離純化及酶學活性的鑒定提供了材料基礎，為進一步闡釋阿魏酸生物合成的分子機制提供了理論參考。