鹽堿脅迫對櫸樹幼苗生長期生理特性的影響

韓浩章，王曉立，張麗華，李素華，王 芳，張 穎，劉 宇

(宿遷學院，江蘇 宿遷，223800)

櫸樹(Zelkovaserrata(Thunb.) Makino)多分布于我國湖南、湖北、安徽、江蘇、浙江等地，其根系發達，樹形優美，葉色豐富，是我國優良的彩葉樹種，在園林綠化中的應用量越來越大[1-2]。目前我國櫸樹成年苗木數量較少，除播種萌芽率極低外，也與干旱、鹽堿等土壤環境對櫸樹幼苗生長發育的影響較大有關[3-5]。研究認為，櫸樹在種子萌發階段對NaCl脅迫敏感，0.10%的NaCl濃度處理即可顯著降低櫸樹種子發芽率、發芽指數和活力指數，當NaCl濃度高于0.20%時，萌發后的櫸樹幼苗生長緩慢、葉片卷曲[6]，生長季櫸樹幼苗在0.30% NaCl土壤中生長，會陸續出現死亡現象[4]。有報道認為，實生選育的櫸樹品種‘恨天高’屬于中等耐鹽堿品種，其幼苗對NaCl的忍受濃度為200～400 mmol·L-1[7]，對NaHCO3的忍受濃度為100～200 mmol·L-1，高濃度NaHCO3脅迫下則出現葉片卷曲、失綠、焦枯、整株死亡等現象[3]。目前，我國園林綠化中大量應用的仍是普通櫸樹，研究重點主要集中在繁殖技術[8-9]、生長特性[10]、葉色變化[1]、耐鹽性[4,7]等方面。我國蘇北地區土壤多為鹽堿土，土壤中除了以NaCl與Na2SO4為主的中性鹽外，還包括以Na2CO3和NaHCO3為主的堿性鹽，櫸樹幼苗在生長季栽培仍會因土壤水分運移導致的土壤表土鹽堿化而出現明顯黃化和葉片卷曲現象[11]。目前關于櫸樹耐堿性鹽脅迫及其機理研究較少。基于此，本研究以普通櫸樹幼苗為材料，檢測堿性鹽環境條件對其生理特性的影響，以期為櫸樹在蘇北地區種苗繁殖和櫸樹耐鹽堿機理研究提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選自宿遷學院櫸屬植物基地實生繁殖、生長正常的1 a生櫸樹幼苗，2019年3月10日移入盆中栽培，盆高24 cm，上口直徑28 cm，每盆3株，分5個處理，每處理15盆，共75盆。栽培土壤pH 8.06、電導率(EC)1078 μS·cm-1、有機質含量11.49 g·kg-1、有效鉀含量17.59 μg·g-1、有效鐵含量11.97 μg·g-1、NH4+-N含量62.39 μg·g-1、NO3--N含量277.29 μg·g-1、有效磷含量34.07 μg·g-1，可溶性鹽含量15.86 mg·g-1。60 d后，以蒸餾水為對照，分別施用50 mmol·L-1、100 mmol·L-1、150 mmol·L-1、200 mmol·L-1的Na2CO3和NaHCO3(物質的量比Na2CO3：NaHCO3=1：1)混合溶液各1 L，pH分別為6.75、8.19、8.77、9.46、9.78。繼續培養21 d后植物生長狀況穩定，此時檢測各處理側枝平均生長量、莖粗、根冠比、根系活力、光合色素含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活力、過氧化物酶(Peroxidase,POD)活力、過氧化氫(Catalase,CAT)活力和總抗氧化能力，5次重復，取平均值進行統計分析。

1.2 試驗方法

側枝平均生長量采用直尺法，檢測櫸樹幼苗側枝在21 d內的平均增長量；莖粗采用游標卡尺法，檢測櫸樹幼苗地上部2 cm處莖干粗度；根冠比采用烘干法[12]，根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[12]，葉綠素含量采用乙醇法測定[12]，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[12]，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法[12]，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸法[12]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[12]，SOD采用氮藍四唑法[12]，POD采用愈創木酚法[12]，CAT活性測定采用紫外分光光度計法[12]，總抗氧化能力采用鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)法[13]。抗鹽堿能力綜合評價采用隸屬函數法[14]，在所有測定指標中，側枝平均生長量、莖粗、根冠比、根系活力、光合色素含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT、總抗氧化能力與抗鹽堿能力成正相關，采用隸屬函數公式：U(Xab)=(Xab-Xamin)/(Xamax- Xamin)，而MDA含量與抗鹽堿能力呈負相關，采用反隸屬函數：U(Xab)=1-(Xab-Xamin)/(Xamax- Xamin)，式中U(Xab)為測定指標的隸屬函數值，Xab為各處理的指標測定值，Xamin為各處理指標測定的最小值，Xamax為各處理指標測定的最大值。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2007進行制表，采用SPSS 21.0進行數據分析，采用最小顯著差異法(LSD)進行數據顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對櫸樹幼苗生長發育的影響

由表1可以看出，隨鹽堿處理濃度的提高，櫸樹幼苗的側枝平均生長量、莖粗、根冠比和根系活力呈先上升后下降趨勢。側枝平均生長量在100 mmol·L-1的鹽堿處理時達最高值，莖粗在150 mmol·L-1的鹽堿處理時達最高值，根冠比和根系活力在50 mmol·L-1的鹽堿處理時達最高值；200 mmol·L-1的鹽堿脅迫顯著降低了櫸樹幼苗的側枝平均生長量、根冠比和根系活力(P<0.05)，莖粗與對照差異不顯著，且少部分植株開始出現葉片卷曲、失綠、焦枯甚至死亡等現象。

表1 不同濃度鹽堿處理條件下櫸樹幼苗生長發育指標變化Table 1 Growth indexes of beech seedling under different concentration of saline-alkali treatment

2.2 鹽堿脅迫對櫸樹幼苗光合色素的影響

由表2可以看出，隨鹽堿處理濃度的提高，櫸樹幼苗的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和總葉綠素含量呈先上升后下降趨勢，葉綠素a/b值基本呈下降趨勢。在100 mmol·L-1的鹽堿處理條件下，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和總葉綠素含量達最高點；200 mmol·L-1鹽堿處理的葉綠素a、總葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和葉綠素a/b值顯著低于對照(P<0.05)，葉綠素b含量與對照差異不明顯。

2.3 鹽堿脅迫對櫸樹幼苗滲透調節的影響

由表3可以看出，隨鹽堿處理濃度的提高，櫸樹幼苗的MDA含量不斷提高，其中200 mmol·L-1鹽堿處理的顯著高于對照(P<0.05)。櫸樹幼苗的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量呈先上升后下降趨勢，150 mmol·L-1的鹽堿處理時櫸樹幼苗的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量達最高值，200 mmol·L-1的鹽堿處理提高了櫸樹幼苗的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量，其中脯氨酸含量顯著高于對照(P<0.05)。

表2 不同濃度鹽堿處理條件下櫸樹幼苗的光合色素含量Table 2 Photosynthetic pigment content of beech seedling under different concentration of saline-alkali treatment

表3 不同濃度鹽堿處理條件下櫸樹幼苗的滲透調節物質和MDA含量Table 3 Osmotic adjustment substances and MDA content of beech seedling under different concentration of saline-alkali treatment

2.4 鹽堿脅迫對櫸樹幼苗抗氧化能力的影響

由表4可以看出，隨鹽堿處理濃度的提高，SOD、POD、CAT和總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，其中SOD和總抗氧化能力的最高值出現在150 mmol·L-1的鹽堿處理時，POD、CAT的最高值出現在50 mmol·L-1的鹽堿處理時。200 mmol·L-1的鹽堿處理時櫸樹幼苗的SOD和總抗氧化能力高于對照，其中SOD顯著高于對照(P<0.05)，而POD和CAT顯著低于對照(P<0.05)。

2.5 櫸樹幼苗耐鹽堿能力綜合評價

綜合評價值D表示抗鹽堿能力大小，D在0～1之間，D值越接近1表示抗鹽堿能力越強，反之則抗鹽堿能力越弱[14]。由圖1可以看出，隨著鹽堿脅迫程度的增加，櫸樹的耐鹽堿能力綜合評價值D呈先增加后降低的趨勢，在150 mmol·L-1鹽堿處理條件下達最大值0.771，在200 mmol·L-1鹽堿處理時迅速下降并遠低于對照，櫸樹幼苗的抗鹽堿能力大大降低，生長發育和相關生理過程受到抑制。

表4 不同濃度鹽堿處理條件下櫸樹幼苗的抗氧化酶活性Table 4 Antioxidant enzyme activities of beech seedling under different concentration of saline-alkali treatment

圖1 櫸樹幼苗耐鹽堿能力綜合評價值Fig.1 Comprehensive evaluation of salt-alkali tolerance of beech seedling

3 結論與討論

研究表明，鹽堿脅迫能夠抑制植物養分吸收和地上部生長發育，降低光合色素含量[14]，嚴重者引起植物根系發育停止、腐爛，葉片干枯，直至整株死亡[15]。在本實驗中，隨鹽堿處理濃度的提高，櫸樹幼苗的側枝平均生長量、莖粗、根冠比、根系活力、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和總葉綠素含量呈先上升后下降趨勢，葉綠素a/b值基本呈下降趨勢，且在50 mmol·L-1的鹽堿處理時根冠比、根系活力達最高值，在100 mmol·L-1的鹽堿處理時側枝平均生長量、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和總葉綠素含量達最高值，在150 mmol·L-1的鹽堿處理時莖粗達最高值，說明低濃度鹽堿處理能夠促進櫸樹幼苗生長發育和光合色素合成，從而保持自身較強的蒸騰作用和光合作用[16]，一方面能提高根部吸收水分的能力，另一方面通過提高植物光合作用合成更多的碳水化合物向根系輸送，促進根系生長和滲透調節物質的合成，用以維系根系對礦質元素及水分的吸收，適應鹽堿土壤環境[17]。而在高濃度鹽堿脅迫下，根際環境中鹽分積聚所造成的高滲透勢以及高pH所造成的營養虧缺首先影響根系的生長和生理代謝，使蔗糖向根系運輸受到抑制，根系滲透調節、養分吸收和物質合成能力下降，進而抑制地上部生長發育和光合作用[18-19]，與張曉磊等[17]在紫花苜蓿上、丁俊男等[20]在桑樹上及張麗華等[21]在猴樟上的研究結果一致。

可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、有機酸和甘露醇等被認為是植物提高自身保持水分的能力、耐受滲透脅迫的主要物質，在鹽堿脅迫條件下含量會迅速提高[18,22]。從本實驗結果來看，櫸樹幼苗的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量隨著鹽堿濃度的提高呈先上升后下降趨勢，在150 mmol·L-1的鹽堿處理時達最高值，此時的MDA含量與對照無顯著差異，地上部生長發育和光合能力增強；200 mmol·L-1的鹽堿處理時，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量下降，但與對照差異不顯著，而MDA和脯氨酸含量顯著高于對照，櫸樹幼苗的地上部生長發育和光合作用受到抑制，說明滲透調節是櫸樹幼苗適應鹽堿脅迫的主要方式之一，而脯氨酸在櫸樹幼苗抵抗高濃度鹽堿脅迫過程中起重要作用[16,23]，其原因可能是脯氨酸除了作為滲透調節物質外，還具有清除活性氧、保護蛋白質結構和保持細胞膜穩定性的功能[18,22,24]，研究也發現脯氨酸通常在堿性鹽脅迫下比中性鹽脅迫積累的更多[25]，在高濃度鹽堿條件下更會大量積累[26-27]，與本研究結果類似。

氧化脅迫是植物受鹽堿脅迫傷害的主要特征之一，能使細胞中編碼與質膜完整性有關及參與膜轉運蛋白的基因表達豐度顯著降低[28]，植物光合作用和植物呼吸過程中的電子傳遞出現異常，植物生長發育受到抑制，MDA含量通常被用以表示植物受到氧化脅迫的傷害程度[19]。在本實驗中，200 mmol·L-1的鹽堿處理下櫸樹幼苗MDA含量顯著高于對照，氧化脅迫傷害明顯。植物通常會依賴SOD、POD、CAT、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GRX)等酶系統和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、抗壞血酸、甘露醇等非酶系統清除活性氧，緩解氧化脅迫[29]，但不同植物的抗氧化酶種類組成有差異。在鹽堿脅迫下，轉Lc-CDPK的水稻的SOD、POD、CAT基因表達量提高[18]，番茄葉片內SOD、APX 以及參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環的抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)活性顯著升高[30]，而沙棘幼苗則主要依賴POD清除H2O2[31]。在本實驗中，隨鹽堿脅迫濃度的提高，SOD、POD、CAT和總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，POD、CAT在50 mmol·L-1的鹽堿處理時達最高值，SOD和總抗氧化能力在150 mmol·L-1的鹽堿處理時達最高值，SOD和總抗氧化能力在200 mmol·L-1的鹽堿處理時下降但仍高于對照，而此時的POD、CAT顯著低于對照，說明不同濃度鹽堿脅迫下櫸樹幼苗體內清除活性氧的抗氧化酶系統成員不一致[32]。150 mmol·L-1的鹽堿處理抑制POD、CAT活性，可能激活了抗壞血酸、谷胱甘肽等其它成員的活性，從而使總抗氧化能力達最高值；200 mmol·L-1的鹽堿處理時，抗氧化系統的所有成員活性被不同程度抑制，植物總抗氧化能力下降，但此時SOD仍顯著高于對照，說明SOD在櫸樹幼苗耐受高濃度鹽堿脅迫過程中起重要作用，與董園園等[33]在羊草上，喬楓等[34]在蠶豆上的結果一致。結合隸屬函數法對櫸樹耐鹽堿能力的評價結果也可以看出，隨著鹽堿脅迫濃度的提高，櫸樹幼苗耐鹽堿能力綜合評價值D從0.314提高至0.771，而在200 mmol·L-1的鹽堿處理時迅速下降，因而櫸樹幼苗在生長期能耐受的鹽堿脅迫閥值可能在150～200 mmol·L-1之間，超過200 mmol·L-1則嚴重影響櫸樹幼苗正常生理功能。

綜上所述，低濃度鹽堿脅迫促進櫸樹幼苗地上部生長發育和光合作用，提高可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調節物質含量，提高抗氧化酶活性，從而提高抗鹽堿脅迫的能力；在高濃度鹽堿脅迫下，櫸樹幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調節物質含量下降，抗氧化酶活性下降，地上部生長發育和光合作用受到抑制；櫸樹幼苗耐受鹽堿脅迫依賴于抗氧化系統的綜合作用，脯氨酸和SOD與櫸樹幼苗耐受高濃度鹽堿脅迫密切相關；通過隸屬函數法計算得到的抗鹽堿能力綜合評價D值結果表明，櫸樹幼苗生長期能耐受的鹽堿脅迫閥值在150～200 mmol·L-1之間。