吳茱萸堿對DSS誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎的保護作用研究

楊 哲，孫榮蔚，王賽男，楊 杰,2，王志剛,2，蔡雪婷,2*，曹 鵬,2**

(1.南京中醫藥大學，江蘇 南京210023； 2.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京210028)

吳茱萸(Tetradium ruticarpum(A.Jussieu)T.G.Hartley)是蕓香科、吳茱萸屬植物。吳茱萸始載于《神農本草經》。吳茱萸性熱味苦、辛，有小毒，有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功，用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥[1]。吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是吳茱萸的主要生物堿活性成分，現代藥理學研究表明其具有抗炎，抗腫瘤作用[2]。作為傳統中藥中的瑰寶，充分探究吳茱萸的有效成分及藥理作用，對其深度開發及合理使用尤為重要。

前期研究表明，吳茱萸堿對于氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(Dxtran sodium sulfate，DSS)誘導的小鼠炎癥性相關結直腸癌(Colitis-associated cancer，CAC)具有顯著的預防作用[3]。CAC的發生與潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)密切相關，長期炎癥刺激致使UC患者出現腸道不典型增生及癌癥的風險明顯高于常人[4]。UC發病多為急性轉為慢性結腸炎，吳茱萸堿是否在結腸炎急性發病階段就會對腸道產生化學預防及保護作用尚未明確，本研究即通過DSS誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎模型探究吳茱萸堿對其的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

吳茱萸堿購自西安凱萌生物技術股份有限公司，葡聚糖硫酸鈉(36-50 kDa)購自MPbio公司(貨號0216011090，批號M8667)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(貨號EK282/3)、IL-10 ELISA試劑盒(貨號EK210/4)、TGF-β1 ELISA試劑盒(貨號EK981)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號EK206/3)、IL-1β ELISA試劑盒(貨號EK201B/3)均購自杭州聯科生物技術股份有限公司；髓過氧化物酶檢測試劑盒(貨號EK0943)購自武漢博士德生物工程有限公司；總一氧化氮檢測試劑盒(貨號S0024)、丙二醛檢測試劑盒(貨號S0131S)、總超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒(貨號S0101S)、Western及IP細胞裂解液(貨號P0013)、細胞與組織裂解液(一氧化氮檢測用，貨號S3090)購自上海碧云天生物技術有限公司；H&E染液(貨號G1005)、糖原染色套裝(貨號G1008)、蘇木素染液(貨號G1004)、分化液(貨號G1005-3)、返藍液(貨號G1005-4)均購自Servicebio；Anti-Oxoguanine 8 antibody(貨號ab206461)、Anti-Nitrotyrosine antibody(貨號ab125106)購自Abcam公司。

1.2 儀器

全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)；低溫高速離心機(Eppendorf公司)；全波長酶標儀(Thermo公司)；-80℃冰箱(Haier公司)；渦旋儀(Scientific Industries公司)；脫水機、包埋機、凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；烤箱(天津市萊玻瑞儀器設備有限公司)；正置光學顯微鏡及成像系統(日本尼康)。

1.3 試驗動物

C57BL/6雄性小鼠40只，6周齡，初始體重20±2 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，合格證編號NO.20201008，生產許可證號SCXK(蘇)2016-0010。小鼠用SPF級鼠普通維持顆粒飼料(儀征安立卯生物科技有限公司)飼喂，飼養于江蘇省中醫藥研究院動物中心，使用許可證號SYXK(蘇)2016-0018。動物試驗方案由江蘇省中醫藥研究院倫理委員會審核并批準。

1.4 DSS誘導小鼠急性潰瘍性結腸炎模型制備及動物分組給藥

小鼠適應性飼養1周后，隨機分為4組，即溶劑對照組，模型組，Evo高劑量組(20 mg·kg-1)，Evo低劑量組(10 mg·kg-1)，每組10只。采用連續7天自由飲用2.5%的DSS水溶液構建急性潰瘍性結腸炎模型，Evo高低劑量組在造模前3天開始灌胃給予相應劑量的Evo(0.5% CMC-Na配制)，直至造模結束后3天。溶劑對照組及模型組每日灌胃相應體積的0.5% CMC-Na溶液。造模及分組給藥如圖1。

圖1 Evo保護DSS誘導急性潰瘍性結腸炎小鼠試驗流程圖Fig.1 Flow chart of Evo protect acute ulcerative colitis mice induced by DSS

1.5 疾病活動指數評分

在試驗過程中，每天記錄小鼠體重、飲食狀態、精神狀態、糞便特征和死亡率。根據小鼠的體重變化、糞便性質和便血進行疾病活動指數(Disease activity index，DAI)評分[5-6]。

表1 疾病活動指數評分標準Table 1 Disease activity index scoring standard

1.6 脾臟重量/結腸長度比值

試驗結束后，眼眶取血收集血清并處死小鼠，取盲腸至肛門處整段結直腸，測量長度并拍照。對小鼠脾臟進行稱重，計算脾臟重量/結腸長度比值。

1.7 腸組織病理學檢查

1.7.1 結腸大體損傷評分

盲法對結腸進行觀察并進行結腸大體損傷評分：0，結腸無損傷；1，充血水腫，無潰瘍；2，有潰瘍，但無明顯炎癥；3，有潰瘍，但只有炎癥；4，有2例以上潰瘍或炎癥，潰瘍大小< 0.5 cm；5，有兩個以上的潰瘍或炎癥，至少有一個潰瘍或炎癥部位> 0.5 cm[7]。

1.7.2 組織學評分

將新鮮的結直腸組織用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，然后依次脫蠟、水化，進行PAS及蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，H&E)、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，最后在光學顯微鏡下觀察組織形態并拍攝。盲法觀察并進行組織學評分：0，正常結腸組織；1，炎癥或潰瘍病變僅出現在粘膜層；2，炎癥或潰瘍病變僅出現在粘膜下層；3，炎癥或潰瘍深部病變；4，對固有肌層、炎癥或潰瘍滲透性病變；5，炎癥或壁通透性大的潰瘍并有明顯的穿孔[8]。

1.8 血清一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量測定

取各組小鼠等量結腸組織，用細胞與組織裂解液(NO檢測用)進行裂解，按照總NO檢測試劑盒說明書，采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，然后通過Griess reagent檢測亞硝酸鹽，540 nm處通過吸光度測定樣品中總NO含量。

1.9 結腸組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量測定

取各組小鼠等量結腸組織，按照WST8法總SOD活性檢測試劑盒說明書進行操作，通過樣品對WST-8產物在450 nm下的吸光度計算樣品中SOD酶活力。

1.10 結腸組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測定

取各組小鼠等量結腸組織，用Western及IP細胞裂解液進行勻漿，勻漿后10000～12000×g離心10 min取上清，將上清各組樣本按照TBA法試劑盒說明書檢測MDA含量。通過單位重量的組織重量來表示最初樣品中的MDA含量。

1.11 結腸組織髓過氧化物酶(Myelopearoxidase,MPO)和炎癥因子含量測定

精密稱取結腸組織，按照重量體積比依照不同試劑盒要求加入相應體積的勻漿介質，自動勻漿機進行勻漿(4℃，勻漿5 s停止2 s，共60個循環)，4℃，12000 r·min-1離心10 min取上清后，按照MPO和炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒說明書在相應吸光度下進行含量測定。

1.12 結腸組織中8-Oxoguanine(8-OHdG)、Nitrotyrosine的表達檢測

通過對各組小鼠的結腸組織石蠟切片進行脫蠟至水后，置于盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)的修復盒中，于微波爐內進行抗原修復，3%雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min以阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，加入不同的一抗進行4℃孵育過夜，后加入相同屬種的二抗室溫孵育50 min，洗滌后用二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染3 min，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。將切片依次放入75%酒精5 min，85%酒精5 min，無水乙醇5 min，新的無水乙醇再次5 min，二甲苯5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并采集圖像，結果分析采用Image J 1.37v軟件，每組隨機抽取相同倍鏡下的六個視野，通過陽性染色面積/總面積百分比半定量蛋白陽性的表達強度。

1.13 統計方法

2 結果

2.1 吳茱萸堿對急性結腸炎小鼠一般活動狀況及DAI評分的影響

模型組小鼠在第5 d出現明顯的精神不振，食欲及飲水量下降，聳背毛發豎立，第7 d出現明顯的體重減輕并伴隨著大便不成形，稀便，呆滯，不好動。隨著DSS的持續攝入，體重仍持續下降，第8 d出現明顯的血便，伴隨死亡。試驗結束后模型組死亡率高達40.0%，Evo低劑量組死亡率25.0%，Evo高劑量組死亡率只有16.7%。DSS組的DAI評分從開始DSS飲水2 d后即比溶劑對照組顯著升高，體重顯著下降，并持續整個試驗過程(P<0.05)。Evo組可顯著改善上述癥狀，DAI評分從第7 d開始較模型組顯著下降(P<0.05)。

圖2 DSS誘導的急性結腸炎模型中各組小鼠的DAI評分和體重變化Fig.2 Initial weight change and DAI score of each group in DSS-induced mice model of acute colitis.注A：各組小鼠體重變化；B：各組小鼠DAI評分變化。與溶劑對照組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，下同。

2.2 吳茱萸堿對急性結腸炎小鼠腸組織學的影響

2.2.1 脾臟重量/結腸長度比值及結腸大體損傷評分

脾臟腫大的臨床意義為機體遭受炎癥侵襲，急性潰瘍性結腸炎結腸縮短也是重要的臨床表現之一。因此，評價脾臟重量/結腸長度值可以直觀的表現出機體的炎癥程度及Evo對急性潰瘍性結腸炎的改善作用[9]。圖3A展示了各組小鼠典型結腸和脾臟形態，溶劑對照組小鼠結腸腸壁完整，紋理清晰，黏膜完整且光滑富有彈性；模型組小鼠結腸通體充血水腫，腸壁明顯增厚，質地硬且彈性變差，具有明顯的潰瘍，盲腸明顯縮小，與溶劑對照組和Evo組相比長度明顯縮短。Evo治療后可明顯降低DSS所造成的結腸長度縮短及潰瘍水腫現象的出現，通過結腸大體損傷評分(圖3C)可以看出Evo對于急性潰瘍性結腸炎有顯著改善作用。與模型組相比，Evo給藥組脾臟重量/結腸長度值明顯降低(Evo 10 mg·kg-1vs 模型組，P<0.05；Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.001)，其中Evo 20 mg·kg-1組對結腸炎小鼠的結腸保護作用尤為突出(圖3B)。

2.2.2 PAS、H&E染色及結腸組織學評分

通過對結腸進行H&E染色(圖4A)和組織學評分可知(圖4B)，溶劑對照組小鼠結腸組織黏膜上皮細胞排列整齊，形態完整，腺體排列整齊，有明顯的正常隱窩結構，杯狀細胞結構完整數量豐富，黏膜各層無炎性細胞浸潤；模型組小鼠結腸出現嚴重的炎癥反應，黏膜各層均有潰破及壞死，大量的中性粒細胞及單核細胞等炎性細胞浸潤，累積至肌層及漿膜，隱窩結構缺失，出現空泡狀，腺體破損，杯狀細胞數量明顯減少。而經Evo干預后，可以明顯減輕炎癥所造成的結腸組織的損傷，Evo 20 mg·kg-1組表現出顯著的炎癥抑制及結腸保護作用，結腸組織可見完整的上皮細胞排列，隱窩結構及杯狀細胞較模型組相比明顯增多，且結構完整，炎癥細胞浸潤減輕。

圖3 Evo對急性結腸炎小鼠結腸的保護作用Fig.3 Protective effect of Evo on colon of mice with acute colitis.注A：各組小鼠典型結腸和脾臟形態；B：各組小鼠脾臟重量/結腸長度值 (n=6)；C：盲法對各組結腸組織進行肉眼觀察并根據評分標準進行結腸大體損傷評分(n=6)。

圖4 不同倍鏡下各組小鼠結腸組織H&E染色及組織學評分Fig.4 H&E staining of colon tissues of mice in each group under different magnification and histological score by blinded.注:A：各組小鼠結腸組織H&E染色；B：組織學評分(n=6)。

采用PAS染色法對中性粘蛋白進行染色，可以間接反映出腸道組織杯狀細胞的數量。如圖5所示，紫紅色顆粒為杯狀細胞所分泌的中性粘多糖，溶劑對照組及Evo各組呈現強陽性，而模型組近乎沒有陽性染色，直觀的說明了各組結腸組織杯狀細胞的數量，證實了Evo對于DSS所誘導的潰瘍性結腸炎的腸道保護作用。

圖 5 各組小鼠結腸組織PAS染色(×50)Fig.5 PAS staining of colon tissues of mice in each group

2.3 吳茱萸堿對急性結腸炎小鼠氧化水平的影響

2.3.1 吳茱萸堿對血清NO含量的影響

臨床研究表明，NO在結腸炎患者體內合成異常，NO合成增加，誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性增高，iNOS活性增加與結腸炎患者炎性程度呈平行關系。同時，iNOS活性增高，導致致癌物質亞硝酸鹽合成增多，是結腸炎患者誘發結腸癌的重要原因之一[10]。過量的NO合成，釋放至組織，導致組織細胞損傷。因此，通過評價各組小鼠血清中NO含量，可全面評估Evo對于結腸炎的改善作用。如圖6A所示，與溶劑對照組相比，模型組血清中NO含量增加(P<0.05)，經Evo干預后，Evo 20 mg·kg-1組小鼠NO含量顯著降低(P<0.01)。

2.3.2 吳茱萸堿對結腸組織MDA、MPO和SOD含量的影響

通過對結腸組織中MDA、SOD、MPO進行含量測定(圖6B-D)，模型組與溶劑對照組相比，MDA、MPO含量明顯增加，SOD含量顯著降低(P<0.001)。Evo給藥組與模型組相比，MDA和MPO含量降低，SOD含量顯著增加(MDA：Evo 10 mg·kg-1vs 模型組，P<0.05；Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.01；MPO：Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.05；SOD：Evo 20 mg·kg-1vs模型組，P<0.05)。

圖6 Evo對DSS誘導急性結腸炎小鼠結腸組織中氧化應激及血清中NO含量的影響Fig.6 Effects of Evo on oxidative stress in colon tissue and NO content in serum of DSS-induced acute colitis mice

2.3.3 吳茱萸堿對結腸組織中氧化損傷產物Nitrotyrosine和8-OHdG的影響

通過對各組小鼠結腸組織中Nitrotyrosine、8-OHdG進行免疫組化分析，評估機體氧化應激水平。通過圖7可以看出，模型組小鼠與溶劑對照組相比，Nitrotyrosine、8-OHdG陽性表達明顯增加(P<0.001)，經Evo各劑量組干預后，陽性表達明顯減少，其中高劑量組保護治療效果較低劑量組明顯。

圖7 Evo對結腸組織中8-OHdG、Nitrotyrosine陽性表達的影響Fig.7 The effect of Evo on 8-OHdG and Nitrotyrosine positive expression in colon tissue注A：結腸組織8-OHdG免疫組化分析代表性切片(×200)，棕黃色為陽性染色(紅色指示為典型陽性表達)；B：8-OHdG 陽性表達統計結果(n=6)。C：結腸組織Nitrotyrosine免疫組化分析代表性切片(x200)，棕黃色為陽性染色(紅色指示為典型陽性表達)；D：Nitrotyrosine陽性表達統計結果(n=6)。

2.4 吳茱萸堿對急性結腸炎小鼠炎癥水平的影響

通過對結腸組織中抗炎因子TGF-β1、IL-10以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量進行測定，評價Evo對于急性潰瘍性結腸炎的炎癥調節作用。模型組與溶劑對照組相比，抗炎因子TGF-β1、IL-10含量明顯降低(P<0.01)。促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯增高(TNF-α：P<0.01；IL-1β：P<0.001；IL-6：P<0.001)。而經過Evo干預后的小鼠結腸組織中，促炎因子含量明顯下降，同時抗炎因子含量明顯升高，差異具有統計學意義(見圖8)。

圖8 Evo對小鼠結腸組織中炎性因子表達的影響Fig.8 Effects of Evo on the expression of inflammatory factors in the colon tissue of mice

3 討論

以往研究炎癥性相關結直腸癌多通過慢性結腸炎模型進行驗證，相較于慢性結腸炎，急性結腸炎發病程度重，發病率高，是慢性結腸炎的必經階段。本研究通過急性結腸炎模型組小鼠相關指標進行測定，發現腸道上皮完整性破壞，氧化應激及損傷嚴重，這些都與炎癥引起的結直腸癌變密切相關。因此，對于炎癥性相關結直腸癌的化學預防，不能僅針對于慢性炎癥階段，在結腸炎急性階段，有效的去預防及干預治療尤為重要。

本次試驗首次證明吳茱萸堿在潰瘍性結腸炎急性階段就可以起到顯著的保護治療作用，降低氧化應激，抑制炎癥及炎癥所造成的細胞癌變。我們通過在DSS造模過程中及造模前3 d和后3 d給予Evo干預，通過對小鼠體重的變化、糞便性狀及便血情況進行DAI評分，用以衡量急性結腸炎疾病的進程。脾臟腫大的臨床意義為機體遭受炎癥侵襲，急性潰瘍性結腸炎結腸縮短也是重要的臨床表現之一。因此，評價脾臟重量/結腸長度值可以直觀地表現出機體的炎癥程度及Evo對急性潰瘍性結腸炎的預防治療作用[5]。我們通過評估各組小鼠脾臟重量/結腸長度值之間的差異，發現模型組小鼠結腸長度明顯縮短，脾臟變大且呈現暗紅色；而溶劑對照組及Evo各組小鼠脾臟重量/結腸長度值均小于模型組，脾臟大小正常，顏色鮮艷。

杯狀細胞是粘蛋白的主要來源，在腸道的保護因素中起到決定性的作用。正常情況下，杯狀細胞呈現錐狀體結構，向胞外分泌富含粘蛋白的粘液顆粒，與水混合后形成粘液，附著于腸粘膜的表面，構成一層膜狀保護結構。因此，杯狀細胞的數量多少和形態可以反映出腸粘膜的健康狀況[11]。通過PAS染色法對杯狀細胞進行染色，發現Evo對于腸道的有效保護及炎癥預防作用。

多數研究認為，結腸炎的發生及惡化與氧化應激及NO代謝異常密切相關。在正常情況下，腸道活性氧(Reactive oxygen species，ROS)具有殺菌作用，參與腸道防御功能。然而，過度ROS產生，超過在宿主抗氧化防御的緩沖能力所衍生的氧化應激會導致脂質過氧化，腸黏膜屏障損傷，細菌移位和炎癥反應[12]。MDA是脂質過氧化的最終產物，被認為是氧化應激下的有害產物，導致組織和器官損傷；MPO是一種在單核細胞和巨噬細胞中表達中性粒細胞和低血小板的酶，MPO活性增強是中性粒細胞浸潤和炎癥的一個重要指標；在氫離子與超氧化物發生反應生成過氧化氫和氧的過程中，SOD充當催化酶作用，減少過渡金屬通過產生自由基引發及氧化應激損傷[13]；臨床研究表明，NO在結腸炎患者體內合成異常，NO合成增加，iNOS活性增高，iNOS活性增加與結腸炎患者炎性程度呈平行關系。同時，iNOS活性增高，導致致癌物質亞硝酸鹽合成增多，是結腸炎患者誘發結腸癌的重要原因之一[14]。8-OHdG作為ROS引起DNA氧化損傷的修飾產物之一，外界炎癥刺激導致機體產生大量的ROS直接攻擊DNA中鳥嘌呤，使得脫氧鳥苷氧化為8-OhdG。因此，機體8-OHdG的含量可以間接反應機體的氧化損傷程度，是目前公認的衡量機體氧化應激及DNA氧化損傷的高效指標[14-15]。氧化應激對蛋白質損傷的一個重要標志物是硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)。Nitrotyrosine是自由基與蛋白質中的酪氨酸殘基相互作用的產物，當炎癥侵襲時，炎性介質與蛋白質酪氨酸殘基或酪氨酸發生硝化反應，酪氨酸硝基化一方面可以反應機體炎癥及氧化應激水平，同時會使體內多種有重要功能的酶和蛋白功能受損[15]。因此，我們驗證了經Evo給藥后血清中NO及結腸組織中MDA、MPO、SOD的含量，免疫組化法測定了結腸組織中8-OHdG及Nitrotyrosine的表達，明確表明Evo可以降低機體氧化應激程度，減少NO的產生，從而減少結腸損傷及誘發結腸癌變。

炎癥因子及抗炎因子在結腸組織中的含量可以最為直觀的體現機體遭受炎癥反應的程度。同時，炎癥刺激導致腫瘤的發生主要與各種炎癥因子及其炎癥因子所參與的相關通路有關，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子對腫瘤基因、表觀遺傳學、各種信號通路均有影響[16-17]。本試驗通過ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎因子TGF-β1、IL-10含量，結果表明Evo可以明顯的降低相關炎癥因子的表達并升高抗炎因子的水平。

綜上所述，吳茱萸堿具有改善急性潰瘍性結腸炎的作用，并可顯著抑制急性腸炎模型小鼠腸道高氧化應激和高炎癥狀態。本研究可為進一步探討吳茱萸堿預防或治療UC、CAC的機理提供研究基礎。