舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利對功能性消化不良大鼠胃黏膜CRF、C-KIT表達的影響

包瑞玲 ，劉文濱 ，丁瑞峰，黎 敏，趙麗紅，段姝婷，張 玲

（1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古包頭 014000；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院中醫科，內蒙古包頭 014010；3.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院消化科，內蒙古包頭 014010；4.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院心功能科，內蒙古包頭 014010）

消化不良是臨床上最常見的癥狀之一，在眾多的患者中，僅有較少的消化不良患者存在器質性損害，大多數患者考慮為功能性消化不良。功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）被定義為來自胃和十二指腸區域的臨床癥狀，多表現為惡心、嘔吐、餐后飽脹感、上腹痛等癥狀，并且排除可以解釋這些癥狀的器質性改變及代謝性異常。FD 全球的發病率為11.5%～29.2%，亞洲地區約為8%～23%［1］。而且FD 患者常常伴隨有抑郁、焦慮及軀體化障礙等精神心理障礙，存在異常的人格特征，多有負性生活事件和生活應激事件的經歷。部分學者研究發現舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利片可有效改善FD 患者臨床癥狀，本實驗通過建立FD 大鼠模型，予以舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利片干預，觀察其對大鼠體質量、胃殘留率、胃黏膜促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）及干細胞因子受體（C-KIT）表達的影響。

1 材料

1.1 動物 30 只健康雄性Wistar 大鼠，由內蒙古醫科大學實驗動物中心提供［許可證號SCXK（蒙）2015-0001］，體質量（160±20）g；動物房溫度22～24 ℃。

1.2 藥物與試劑 舒肝解郁膠囊（四川濟生堂藥業有限公司生產，批號Z20174037，0.36 g／粒）；枸櫞酸莫沙必利分散片（魯南制藥有限公司生產，批號H20031110，5 mg／片）；CRF 抗體（英國abcam 公司，貨號ab8901）；C-KIT 抗體（南昌英俊科技開發有限公司，貨號AF4701）。

2 方法

2.1 造模與分組 夾尾刺激+不規律飼養法［2］造模。30 只Wistar 雄性大鼠適應性飼養7 d，隨機分為空白組、模型組、舒肝解郁+莫沙必利組，每組10 只。空白組不加任何干預，自然飼養，其余各組依照上述造模方法處理，造模1 周。造模結束后，空白組、模型組每只大鼠以生理鹽水1 mL／100 g 灌胃；舒肝解郁+莫沙必利組以莫沙必利1.37 mg／kg、1 mL／100 g 灌胃；舒肝解郁膠囊以15 mg／mL、1 mL／100 g 灌胃，大鼠與人臨床用藥劑量、體型系數公式［dB＝dA×RB／RA×（WA／WB）／3］）分別配制懸濁液。每周測量大鼠體質量，根據體質量變化調整用藥劑量。

2.2 體質量 記錄造模期間大鼠體質量變化。

2.3 胃殘留率測定實驗第21 天，各組大鼠禁食不禁水24 h，每只大鼠予1 mL／100 g 營養半固體米糊（10 g 羧甲基纖維素鈉、16 g 奶粉、8 g 糖、8 g 淀粉及250 mL 蒸餾水共同配制）灌胃，40 min 后予20% 烏拉坦（1 mL／100 g）腹腔麻醉后進行開腹，將大鼠腸胃分離，結扎賁門和幽門取胃，濾紙吸干水分稱胃全重（m1），沿胃大彎側剪開，去除胃內容物，PBS 緩釋液清洗胃，濾紙吸干，稱得胃凈重（m2），胃內殘留物質量占營養半固體米糊質量的百分比為胃殘留率，測胃殘留率＝ ［（m1-m2）／營養半固體米糊質量］×100%。

2.4 觀察各組大鼠胃黏膜CRF、C-KIT 的表達情況

2.4.1 Western blot 距幽門0.5 cm 處取2 塊胃竇壁組織（1 cm×1 cm），分別裝入4%甲醛容器及凍存管中保存，將凍存管迅速放置液氮罐中等待檢測。將組織從液氮中取出，裂解提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度、制膠及上樣、電泳、蛋白質電轉移和膜封閉、抗原抗體反應、顯影、漂洗、定影、最后清水沖洗晾干保存、掃描，用IPP 軟件對掃描圖象的目的條帶進行灰度分析。

2.4.2 免疫組化 取材，固定，脫水浸蠟，包埋，切片，撈片，烤片，微波爐抗原修復—滴加5% BSA 封閉液，室溫20 min；滴加適當稀釋的一抗，4 ℃過夜，PBS（pH 7.4）洗3 次，2 min／次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫20 min，PBS 洗；滴加試劑SABC，室溫20 min，PBS 洗4 次，5 min／次；DAB 顯色，蘇木素輕度復染，在通風櫥中晾干后，中性樹膠封片—顯微拍照。每張切片選擇互不重疊的視野在顯微鏡下觀察，測定單位面積的陽性細胞數表達（平均光密度），代表其表達情況。具有臨床病理工作5 年以上經驗的兩名病理醫生閱片。

2.5 統計學分析 所有數據均使用SPSS 25.0 統計軟件進行統計學分析，首先進行方差齊性、正態分布檢驗，計量資料以（）表示，多組間比較選用單因素方差分析，方差齊時選用LSD 檢驗，方差不齊時選用非參數cruskalwallis 檢驗；P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠體質量變化值及胃殘留率 與空白組比較，模型組體質量下降（P＜0.05），與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組體質量上升（P＜0.05），見表1；與空白組比較，模型組胃殘留率升高（P＜0.05），提示模型組胃動力減弱；與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組胃殘留率下降（P＜0.05），見表2，符合FD 大鼠模型。

表1 各組大鼠體質量差值比較（g，，n＝10）

表1 各組大鼠體質量差值比較（g，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

表2 各組大鼠胃殘留率比較（%，，n＝10）

表2 各組大鼠胃殘留率比較（%，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3.2 胃黏膜CRF 表達情況 與空白組比較，模型組、舒肝解郁+莫沙必利組胃CRF 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組胃CRF 的表達降低（P＜0.05），見表3～4、圖1。

表3 Western blot 檢測各組大鼠胃CRF 表達（%，，n＝10）

表3 Western blot 檢測各組大鼠胃CRF 表達（%，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3.3 胃黏膜C-KIT 表達情況 與空白組比較，模型組、舒肝解郁+莫沙必利組胃C-KIT 表達降低（P ＜0.05）；與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組胃C-KIT 的表達升高（P＜0.05），見表5～6、圖2。

表4 免疫組化法檢測各組大鼠胃黏膜CRF 表達比較（μm，，n＝10）

表4 免疫組化法檢測各組大鼠胃黏膜CRF 表達比較（μm，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

表5 Western blot 檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（%，，n＝10）

表5 Western blot 檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（%，，n＝10）

注：與空白組比較，?P ＜0.05；與模型組比較，▲P ＜0.05。

圖1 Western blot 檢測各組大鼠胃竇組織CRF 蛋白表達

表6 免疫組化法檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（μm，，n＝10）

表6 免疫組化法檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（μm，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測各組大鼠胃竇組織C-KIT 蛋白表達

4 討論

FD 是多種因素參與的疾病，其中胃十二指腸動力異常、內臟高敏感、精神因素是其公認的發病機制［3］。目前部分學者將舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利用于功能性胃腸病治療中。舒肝解郁膠囊由刺五加及貫葉金絲桃組成，貫葉金絲桃是目前國內外報道最多、作用機制最明確的抗抑郁單方中藥，主要用于輕中度抑郁患者的治療［4-6］。莫沙必利為選擇性5-HT4受體激動劑，通過興奮胃腸道膽堿能中間神經元及肌間神經叢5-HT4受體，促進乙酰膽堿釋放，增加胃蠕動，促進胃排空。舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利可有效改善FD 患者臨床癥狀，降低復發率［7-8］。本實驗應用夾尾及不規律飲食法制備FD 大鼠模型，模型組大鼠體質量下降，胃殘留率增加。應用舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利治療，FD 大鼠體質量增加，胃殘留率下降，有效改善FD 大鼠病癥。

內臟高敏感是導致FD 發生的重要發病機制之一。研究顯示約34%～64% FD 患者存在對胃擴張的高敏感［9-12］。Caldarella 等［13］研究發現FD 患者不僅對胃底擴張的敏感性增強，而且對胃竇擴張呈現出高敏狀態。而在應激反應中CRF 起著舉足輕重的作用，CRF 是一種重要的神經內分泌肽，主要分布于中樞神經系統中與應激反應相關的區域，也存在于如胃腸道等外周區域。CRF 通過迷走中樞及外周途徑參與了胃腸道應激反應過程［14］，可抑制副交感神經和提高交感神經活動，是調解下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統的關鍵。在慢性應激小鼠中CRF 含量增高，經治療后CRF濃度降低，胃排空率增加，從而減弱內臟敏感性［15-16］。FD大鼠胃CRF 陽性細胞表達數較空白組增高。予以舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利片治療后，胃CRF 陽性細胞數及WB 表達明顯下降。舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利對FD 大鼠病癥治療效果明顯，其作用機制可能是通過下調胃CRF 的表達，減弱內臟高敏感相關。

Cajal 間質細胞（ICC）作為胃腸道的慢性起搏細胞，分布在胃腸道的各個部位，越來越多的研究表明，Cajal 間質細胞的減少可導致胃腸道動力障礙［17-18］。而幾乎所有ICC 都特異性表達C-KIT 受體［19］，C-KIT 受體又稱干細胞因子受體，干細胞因子（SCF）與C-KIT 通過胞外結構域1～3 區結合后激活一系列的信號分子，從而調節ICC 的增值、分化、發育和結構的完整性［20-21］，C-KIT 的表達下降可導致ICC 表型轉化異常，失去相應的功能［22］。本實驗表明舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利片可上調C-KIT 的表達，改善胃動力，促進胃排空，達到治療功能性消化不良的目的。也有研究發現C-KIT 的過度激活導致ICC 發生變化可能是胃腸道內臟敏化發生的重要的基礎［23-25］。本實驗驗證舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利對功能性消化不良病癥具有明顯治療意義，以期為舒肝解郁膠囊的臨床應用提供理論依據。