美花石斛醇提物對(duì)高尿酸血癥小鼠的影響

張凱惠 ，許立拔，馮成晶，張渝偲，韋露玲，滕建北?

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530200）

痛風(fēng)是一種嘌呤及尿酸代謝障礙引起的疾病，為臨床難治性疾病之一，而高尿酸血癥是引起痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)和最危險(xiǎn)的因素［1］。亦有研究表明5%～12%的高尿酸血癥患者因?yàn)殚L(zhǎng)期不愈終發(fā)展為痛風(fēng)［2］。高尿酸血癥的主要發(fā)病原因有尿酸生成增多和尿酸排泄減少兩條途徑，其中尿酸經(jīng)腎排泄量減少是引發(fā)痛風(fēng)的主要原因，占患者總數(shù)的80%～85%［3］。目前對(duì)高尿酸血癥的西藥治療包括別嘌呤醇、苯溴馬隆非布司他和丙磺舒等，雖療效尚可，但靶點(diǎn)較單一，副作用較大，患者難以耐受，依從性亦較差［4-5］。故探尋有效且毒副作用小的中藥有著比較重要的意義。

美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe 為蘭科植物石斛重要的基原植物，其藥用部位為莖［6］。石斛在2 000 年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》 中便有載，并被列為上品［7］。主要分布于廣西、貴州、廣東和云南等省。其性味甘、微寒，歸胃、腎經(jīng)，具清熱、補(bǔ)腎陰之功效。用于治療治療胃陰不足，病后虛熱不退，目暗不明等癥［6］。現(xiàn)在對(duì)于石斛的藥理學(xué)研究主要集中在緩解糖尿病及其并發(fā)癥、增強(qiáng)免疫，抗腫瘤、抗炎、保護(hù)心血管、改善胃腸功能等方面［8］。而對(duì)于高尿酸血癥的研究卻未見(jiàn)報(bào)道，本研究進(jìn)行美花石斛乙醇提取物對(duì)次黃嘌呤誘導(dǎo)急性高尿酸血癥模型小鼠尿酸水平及血清和肝臟的黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性影響，以及對(duì)氧嗪酸鉀致慢性高尿酸血癥模型小鼠尿酸及肌酐水平的影響研究，探討美花石斛乙醇提取物降尿酸機(jī)制，以期為抗高尿酸血癥藥物的新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 KM 小鼠，SPF 級(jí)，雄性，18～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 美花石斛采自廣西百色市德保縣燕垌鄉(xiāng)下欽村，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱華教授鑒定為蘭科植物美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe；別嘌醇片（上海信宜萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)05180302）；氧嗪酸鉀（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C10237039）；次黃嘌呤（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)J1817203）；4%多聚甲醛（合肥白鯊生物科技有限公司，批號(hào)1804895）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160704）；尿酸（UA）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、腺苷脫氨酶（ADA）、肌酐（Cr）、考馬斯亮藍(lán)等檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20181229、20190104、20190103、20180813、20181229）。

1.3 儀器 Infinite M200pro 型酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；BL-2000F 型電子天平（天津丹納赫西特傳感工業(yè)控制有限公司）；SIM-F140AY65-PC 型制冰機(jī)（日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社）；BSA224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）；Centrifuge 5424 R 型冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；RE-5205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Direct-Q 5 UV-R 型純水儀（美國(guó)默克密理博公司）。

2 方法

2.1 藥液制備 取美花石斛鮮品，于烘箱45 ℃烘干后粉碎，過(guò)2 號(hào)篩，按照參考文獻(xiàn)［9］，加10 倍量70%乙醇浸泡1 h，加熱回流提取2 次，2 h／次，合并續(xù)濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，水浴鍋蒸干成浸膏，取適量浸膏，加0.3%CMCNa，充分混勻成混懸液，依次配制成高（156 mg／mL）、中（78 mg／mL）、低（39 mg／mL）質(zhì)量濃度的藥液（藥物濃度及劑量按生藥計(jì)），臨用現(xiàn)配。

2.2 分組、給藥及造模

2.2.1 對(duì)急性高尿酸血癥小鼠的影響［10］取KM 小鼠60只，隨機(jī)分為6 組，正常組、模型組、美花石斛醇提物低、中、高劑量組（780、1 560、3 120 mg／kg）（中劑量按2020 年版《中國(guó)藥典》 石斛人用量12 g／d 計(jì)算），別嘌醇片組（10 mg／kg），每組10 只。按照20 mL／kg 灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)7 d，正常組與模型組給予等體積0.3%CMC-Na。第7 天灌胃給藥后1 h，除正常組腹腔注射等體積生理鹽水外，模型組與各給藥組小鼠腹腔注射給予次黃嘌呤溶液（100 mg／mL，10 mL／kg）誘導(dǎo)急性高尿酸血癥模型，同時(shí)撤去飼料，禁食不禁水。造模后0.5 h，均摘眼球采血，4 ℃靜置2 h，置于冷凍離心機(jī)4 ℃，3 500 r／min離心15 min，取上層澄清液分別測(cè)定SUA 水平以及XOD 和ADA 活性，于冰臺(tái)快速分離肝臟，勻漿器勻漿后測(cè)定XOD、ADA 活性。

2.2.2 對(duì)慢性高尿酸血癥小鼠的影響實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［11］，取KM 小鼠60 只，隨機(jī)分為6 組，正常組、模型組、美花石斛醇提物低、中、高劑量組（780、1 560、3 120 mg／kg），別嘌醇片組（10 mg／kg），每組10 只。除正常組外，各組小鼠均每天腹腔注射給予氧嗪酸鉀（250 mg／kg，10 mL／kg）以復(fù)制慢性高尿酸血癥模型，并于造模后1 h，灌胃給予各組小鼠相應(yīng)的藥物治療，正常組與模型組給予等量0.3%CMC-Na 溶液，每天1 次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后1 h，均摘眼球采血，4 ℃靜置2 h，于冷凍離心機(jī)4 ℃，3 500 r／min 離心15 min，取上層澄清液分別測(cè)定SUA、SCr，于冰臺(tái)快速分離腎臟，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，伊紅-蘇木素（HE）染色，用于組織病理學(xué)檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)分析，用（）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性，多組間比較采用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和／或方差齊性，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)急性高尿酸血癥小鼠的影響 如表1～2 顯示，與正常組比較，模型組尿酸水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，美花石斛低、中、高劑量組均可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平（P＜0.01），尿酸抑制率分別為39.34%、29.45%、26.83%。與正常組比較，模型組可提高血清和肝臟XOD、ADA 水平（P＜0.01），美花石斛低、中、高劑量組對(duì)高尿酸血癥小鼠的血清和肝臟XOD、ADA 均有抑制作用（P ＜0.01）。

表1 美花石斛對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸與血清X(qián)OD、ADA 活性的影響（，n＝10）

表1 美花石斛對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸與血清X(qián)OD、ADA 活性的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

表2 美花石斛對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟XOD、ADA 活性的影響（，n＝10）

表2 美花石斛對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟XOD、ADA 活性的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.2 對(duì)慢性高尿酸血癥小鼠的影響 如表3 顯示，與正常組比較，模型組尿酸水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，美花石斛低、中、高劑量組均可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平（P＜0.01），尿酸抑制率分別為35.33%、33.98%、31.43%。與正常對(duì)照組比較，模型組SCr 水平升高（P＜0.01），美花石斛給藥組的SCr 水平比較模型組下降（P＜0.01）。

表3 美花石斛70% 醇提物對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸與SCr水平的影響（，n＝10）

表3 美花石斛70% 醇提物對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸與SCr水平的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.3 對(duì)小鼠腎臟組織病理改變的影響 如圖1 顯示，正常組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理性改變。模型組與美花石斛組均可見(jiàn)不同程度的病理性改變，腎小球萎縮，腎小管擴(kuò)張較明顯，并未見(jiàn)尿酸鹽結(jié)晶沉積。與模型組比較，美花石斛各劑量組腎臟病理性改變的程度均有所減輕。

圖1 小鼠腎臟組織病理改變（HE，×400）

4 討論

高尿酸血癥與痛風(fēng)、尿酸性腎病、高血壓、心血管疾病等有著緊密的聯(lián)系［12］，故抗痛風(fēng)新藥的研發(fā)有著十分重要的意義。臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥治療高尿酸血癥有較好效果［13］，高尿酸血癥在中醫(yī)中并無(wú)明確的記載，從臨床上看屬中醫(yī)中的“歷節(jié)”“痛痹”等癥，其因過(guò)食高粱厚味，致濕熱內(nèi)蘊(yùn)，兼外感風(fēng)寒，侵襲經(jīng)絡(luò)，氣血津液運(yùn)行受阻，致濕熱煎熬成痰、瘀凝脈絡(luò)使關(guān)節(jié)紅腫灼痛；亦有先天稟賦不足，年老體虛、脾腎功能失調(diào)，脾失健運(yùn)、腎失氣化，分清別濁失司、蘊(yùn)久化熱、濕熱內(nèi)生、聚痰留瘀而致風(fēng)濕痰瘀、痹阻經(jīng)絡(luò)［14-15］。美花石斛其性味甘、微寒，具清熱、補(bǔ)腎陰之效。本實(shí)驗(yàn)以上述理論為基礎(chǔ)，對(duì)其降尿酸作用進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头謩e采用次黃嘌呤和氧嗪酸鉀鹽為化學(xué)誘導(dǎo)劑復(fù)制高尿酸血癥模型，氧嗪酸的結(jié)構(gòu)與尿酸的嘌呤環(huán)類(lèi)似，可競(jìng)爭(zhēng)地與尿酸酶結(jié)合，從而抑制尿酸酶的活性，形成高尿酸血癥模型，模型簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，但其不能反映減少尿酸生成藥物的降尿酸作用［10］；次黃嘌呤為尿酸生成的前體物質(zhì)可以復(fù)制較穩(wěn)定的模型，小鼠血清尿酸在給藥0.5 h 后達(dá)到高峰，高尿酸狀態(tài)可維持24 h。因雌激素可使血尿酸水平明顯下降［16-17］，可能會(huì)導(dǎo)致造模不穩(wěn)定，故選擇雄鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，美花石斛70%乙醇提取物可顯著降低由次黃嘌呤誘導(dǎo)的急性高尿酸血癥小鼠及由氧嗪酸鉀復(fù)制的慢性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平；可降低模型小鼠的血清肌酐水平，肌酐水平是評(píng)價(jià)腎功能的一個(gè)重要指標(biāo)，一般腎功能受損會(huì)導(dǎo)致肌酐排泄障礙，可引起血清肌酐水平升高［18］。說(shuō)明美花石斛醇提物對(duì)小鼠腎功能具有一定的保護(hù)作用，可減少甚至逆轉(zhuǎn)高尿酸血癥對(duì)腎臟造成的損傷，改善小鼠腎功能，進(jìn)而可能會(huì)促進(jìn)小鼠腎臟對(duì)尿酸的排泄；可顯著抑制模型小鼠血清與肝臟黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性，黃嘌呤氧化酶為體內(nèi)核酸代謝的重要酶，可將體內(nèi)黃嘌呤與次黃嘌呤氧化后生成尿酸，尿酸產(chǎn)生過(guò)多、腎臟尿酸排泄障礙將導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生［19］。腺苷脫氨酶亦是核苷代謝中重要的酶類(lèi)，屬巰基酶，其先催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷，再經(jīng)核苷磷酸化酶作用轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤，終代謝產(chǎn)物為尿酸，而攝入過(guò)多嘌呤類(lèi)食物，腺苷脫氨酶、黃嘌呤氧化酶活性均可能異常升高，使尿酸生成增多［20］，故認(rèn)為美花石斛可通過(guò)減少尿酸的生成降低小鼠血清尿酸水平。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)表明美花石斛提取物可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，其作用機(jī)制為抑制小鼠黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶的活性，從而減少尿酸的生成；美花石斛亦可改善小鼠腎臟功能，進(jìn)而可能促進(jìn)尿酸的排泄；實(shí)驗(yàn)亦證明，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，進(jìn)行中藥新功能的探索研究是可行的。