不同梔子品系果實中活性成分累積規律探究

劉春雷，劉燕琴，陳艾萌，曹 敏，唐祥友，胡開治

（1.重慶市藥物種植研究所，重慶南川 408435；2.四川省內江市農業科學院，四川內江 641000）

梔子為臨床中常用的清熱利濕、涼血解毒中藥，來自茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實。梔子的主要活性成分包括環烯醚萜苷類、二萜類、三萜類、有機酸酯類及黃酮類等［1-5］，具有保肝利膽［6］、調節血糖［7］、抗炎［8］、抗氧化［9］等作用。梔子苷屬環烯醚萜苷類，為梔子的指標成分，同時也是主要的藥效成分，其含量的高低直接影響著藥材的品質。

西紅花苷又稱藏紅花素，是名貴中藥藏紅花的主要有效成分，現代研究表明，西紅花苷具有抗腫瘤［10］、治療心血管疾病［11］、改善記憶力［12］、抗抑郁［13］等作用，具有極高的藥用和經濟價值，主要來源于藏紅花花朵中的3 個柱頭，其產量極低、珍稀難求，被稱為藥材中的“紅色黃金”。梔子是少數能夠合成西紅花苷的植物之一，并且資源豐富、產量高，因此探索梔子中西紅花苷的累積規律及提取工藝成為了近年來的研究熱點。相關學者以雜合的梔子栽培群體或市場購買樣品作為供試材料，開展了相關累積規律研究［14-17］，發現不同時期梔子果實中梔子苷、西紅花苷含量存在較大差異［18-19］。中藥材的活性成分通常為次級代謝產物，其合成積累受到多種因子綜合的影響，其中遺傳因素最為重要，研究表明，不同種質梔子果實的梔子苷、西紅花苷含量存在較大差異［20-21］，但不同梔子品系的梔子苷、西紅花苷累積規律是否一致目前尚未見報道，在大力推進中藥材良種應用的時期，本研究以渝梔1 號、渝梔2 號、4-1 號梔子品系為對象，采用HPLC 法測定不同采收期果實中的梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的含量，以期為分類和定向需求采收梔子提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及樣品采集 試驗材料為項目組前期審定及選育的渝梔1 號、渝梔2 號、4-1 號梔子無性系，于2016 年3 月下旬，選取長勢一致的一年生扦插苗，種植于重慶市南川區重慶市藥物種植研究所梔子基地，經緯度為 E107.21588°，N29.134555°，海拔590 m，試驗點為肥力適中的砂壤土，采用耕地機松土、整平。按照株行距1.3 m×1.7 m，分別種植約100 m2，采用同一方法管理，每年人工除草2 次，均不噴灑農藥和施用肥料，以減少人為干涉。

樣品采集，于2018 年7 月23 日起，每隔20 d取樣，每個品系隨機選取5 株，每株摘取8 個果實進行混合，重復3 次。將采集的梔子果實樣品，置沸水中略燙后，置于40 ℃烘箱中烘干，粉碎，過4 號篩后備用。

所用乙腈和甲醇分別為色譜純、分析純，均為成都市科龍化工試劑廠生產。對照品梔子苷（批號PS010461，純度99.6%），購自成都普思生物科技股份有限公司；西紅花苷Ⅰ（批號111588-201704，純度88.4%）、西紅花苷Ⅱ（批號11589-201705，純度92.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法學考察及樣品測定

1.2.1 色譜條件 迪馬Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 min，15%A；10 min，20%A；15 min，25%A；25 min，40% A；30 min，15% A；35 min，15%A）；體積流量1 mL／min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長梔子苷238 nm，西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ440 nm。

1.2.2 對照品及供試品溶液制備 精密稱定適量的梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ對照品，制備成質量濃度分別為0.75、0.5、0.5 mg／mL 的貯備液，然后分別取適量的對照品貯備液，稀釋成梔子苷質量濃度分別為 30、90、150、210、270、330 μg／mL；西紅花苷Ⅰ質量濃度分別為4、12、20、28、36、44 μg／mL；西紅花苷Ⅱ質量濃度分別為2、6、10、14、18、22 μg／mL 的混合對照品溶液。

稱取梔子粉末0.1 g，加入30 mL 甲醇，超聲30 min，冷卻后，用甲醇溶液定容至50 mL，濾過，即得供試品溶液。

1.2.3 線性關系考察 分別精密吸取不同質量濃度的混合對照品溶液10 μL，在“1.2.1”項條件下測定，以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X），進行回歸，得梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的回歸方程分別為Y＝1 393 826.904 1 X-424 051.082 2（r＝0.998 1）；Y ＝6 427 572.142 9 X+6 713.019 0（r＝0.999 8）；Y＝7 517 001.428 6 X-13 160.171 4（r＝0.999 6）。表明梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ分別在30～330、4～44、2～22 μg／mL范圍內線性關系良好。色譜圖見圖1。

1.2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，在“1.2.1”項條件下連續進樣6 次，記錄峰面積。測得梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ峰面積RSD 分別為0.96%、1.18%、0.74%，表明儀器精密度良好。

1.2.5 重復性試驗 精密稱取同一梔子樣品5 份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取10 μL，在“1.2.1”項條件下進樣。測得5 份樣品梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的平均含量分別為 5.22%、1.35%、0.25%，RSD 分別為1.54%、1.38%、0.92%。表明該方法重復性良好。

1.2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在“1.2.1”項條件下，分別于2、4、8、16、24、48 h進樣，測得梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量RSD 分別為0.58%、1.10%、1.74%。結果表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

1.2.7 加樣回收率試驗 精確稱取已知梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量的梔子樣品0.05 g，共6 份。根據其含量，分別等量加入梔子苷對照品3.210 5 mg、西紅花苷Ⅰ對照品0.665 5 mg、西紅花苷Ⅱ對照品0.113 mg，在“1.2.1”項條件下進樣。測得梔子苷、西紅花苷、西紅花苷Ⅱ的平均回收率分別為98.72%、97.31%、98.11%，RSD 分別為1.21%、1.04%、1.47%。

1.2.8 樣品含量測定 取各供試梔子樣品，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“1.2.1”項條件下進樣10 μL，測定峰面積，計算含量。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

1.3 數據處理 采用SPSS 19.0 軟件對結果數據進行方差分析及多重比較，利用GraphPad Prism 6軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同時期梔子苷含量變化 3 個梔子品系不同生長期的梔子苷含量見表1。結果顯示，不同生長期間，梔子苷含量具有顯著差異。在生長前期（T1～T5），3 個梔子品系的梔子苷含量均呈下降趨勢。T1 時期渝梔1 號、渝梔2 號、4-1 號的梔子苷含量平均約為T8 時期的2 倍。

由圖2 可知，在梔子果實成熟后期，不同品種間的變化規律略有不同，渝梔1 號的梔子苷含量于T6 時期降至最低后，略微增加，但T6、T7、T8 3個時期的梔子苷含量差異不顯著。而渝梔2 號和4-1 號的梔子苷含量分別在T5、T6 時期降至較低水平，略微增高后，在T8 時期顯著降低。

2.2 不同生長期樣品中西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ的含量變化 由表2 可知，不同生長期間，西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ含量均有顯著差異。隨著果實的成熟，3 個梔子種質的西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ的含量均逐漸增加，并在T8 時期達到最高峰。其中，4-1 號梔子的西紅花苷I 含量最高，分別為渝梔1號、渝梔2 號的1.14、1.7 倍；渝梔1 號的西紅花苷Ⅱ含量最高，較渝梔2 號、4-1 號分別高78.3%、11.1%。

表1 不同生長期樣品中梔子苷含量（，%，n＝3）Tab.1 Contents of gardenoside in samples at different growth stages（，%，n＝3）

表1 不同生長期樣品中梔子苷含量（，%，n＝3）Tab.1 Contents of gardenoside in samples at different growth stages（，%，n＝3）

注：同列數據后小寫字母不同者表示差異顯著，大寫字母不同者表示差異極顯著。

圖2 不同生長期樣品中梔子苷含量變化趨勢Fig.2 Trend of gardenoside content variations in samples at different growth stages

不同梔子品系的西紅花苷總量變化趨勢顯示，8 月份（T2）至10 月份（T6），是梔子西紅花苷的快速積累期，10 月之后趨于平緩。見圖3。

圖3 不同生長期樣品中西紅花苷總量含量變化趨勢Fig.3 Trend of total crocin amount variations in samples at different growth stages

表2 不同時期樣品中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量（，%，n＝3）Tab.2 Contents of crocin Ⅰand crocin Ⅱin samples at different growth stages（，%，n＝3）

表2 不同時期樣品中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量（，%，n＝3）Tab.2 Contents of crocin Ⅰand crocin Ⅱin samples at different growth stages（，%，n＝3）

注：同列數據后小寫字母不同者表示差異顯著，大寫字母不同者表示差異極顯著。

3 討論

藥用植物更加注重質量，品質的高低則與其活性成分的含量直接相關。研究表明梔子苷于梔子花期結束后8 周（7、8 月份）左右，其含量增加至最高［22］，然后逐步降低，中、晚期果又緩慢增加，最后達到一個平衡值［18］。本研究中，隨著果實成熟，梔子苷的含量在生長前期呈逐漸降低的趨勢，成熟果實中梔子苷含量僅約為8 月份幼果的50%，這與前人研究結果一致［18，20］。但在成熟后期，不同品系間，具有一定差異，渝梔2 號、4-1 號的梔子苷含量分別在10 月上旬、10 月末降至較低水平，略微增加后，再次顯著降低，而渝梔1 號最后3 個時期的梔子苷含量差異不顯著，較為穩定。這可能與不同梔子品種的成熟度有關，渝梔1 號為晚熟品種，其果實成熟期為12 月中旬，渝梔2 號和4-1 號均為早熟品種，成熟期為11 月中下旬，表明梔子果實過度成熟會造成梔子苷進一步降解。

西紅花苷也為梔子的主要活性成分之一，影響著梔子的品質。劉和平等［18］對水梔子進行研究發現西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ均隨著果實的生長逐漸升高，并在成熟末期（12 月初）達到最高，而陳陽等［23］對采集于瀘州的梔子樣品分析結果顯示，西紅花苷的含量于11 月中旬達到最高為1.32%，隨后趨于下降。在本研究中，渝梔1 號、渝梔2號、4-1 號梔子的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量均隨著果實的生長，在8 月到10 月間快速積累，然后緩慢增加，這與文獻［18］的研究結果一致。

中藥材是由多種活性成分構成的復雜體系，因此單以指標成分含量測定結果，并不能全面、準確地反映藥材質量的優劣［24-25］，以梔子苷、西紅花苷作為評價指標，渝梔1 號的適宜的收獲期為12月上旬，而渝梔2 號和4-1 號應11 月中旬，這與其梔子果實的成熟期也較為一致。

本研究探討了3 個梔子品系的梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的累積規律，結果表明，不同梔子品系間，3 種活性成分含量及梔子苷的累積規律具有一定差異，并根據梔子苷及西紅花苷的變化規律，確定了渝梔1 號、渝梔2 號、4-1 號梔子適宜的采收期，以期為梔子的良種選育及規范化生產提供參考。