金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞損傷的影響

王西彬，左瑞庭

［1.河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院） 脊柱科，河南鄭州 450002；2.河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院） 風濕科，河南鄭州 450002］

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種主要累及骶髂關節、脊柱的慢性進行性炎性疾病，嚴重者可致脊柱畸形和關節強直［1］。至今該病發病機制仍未明確，目前亦無根治方法，患者后期可因關節強直致殘，嚴重影響患者生存質量［2-3］。骶髂關節炎是AS 的主要標志特點，骶髂關節病理組織活檢發現，骶髂關節炎以軟骨破壞、纖維化等變性，軟骨下骨板及骨髓炎癥細胞浸潤、血管翳形成、骨質破壞等為主要表現。軟骨細胞是關節軟骨中的唯一一種細胞，在維持關節功能方面發揮著重要作用。因此，研究骶髂關節軟骨細胞的損傷，能夠為骶髂關節炎的治療提供理論依據，對早期阻斷或者延緩關節強直的發生具有重大的臨床意義。

金絲桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種天然的黃酮醇苷類化合物，存在于金絲桃科、薔薇科、桔梗科、唇形科等多種植物中，具有抗氧化、抗炎、心肌保護等多種藥理學活性［4-5］，在腫瘤、心肌缺血、肝損傷等多種疾病中具有重要的作用［6-8］，但金絲桃苷對于軟骨細胞損傷的作用未見相關報道，因此，本研究用白介素（interleukin，IL）-1β 誘導小鼠骶髂關節軟骨細胞損傷模型，觀察金絲桃苷對于軟骨細胞損傷的作用并進行初步的機制探討，以期為臨床治療關節炎提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 金絲桃苷標準品（質量分數≥98%，批號B20631，上海源葉生物科技有限公司）；IL-1β（美國Sigma 公司，批號SRP8033）；DMEM 培養液（批號 12491023）、胎牛血清（批號2094466RP）、Ⅱ型膠原酶（批號17101015、胰蛋白酶（批號25300054）購自美國Gibco 公司；MTT（批號G020-1-1）、IL-6（批號H007）、TNF-α（批號H052）、Col-Ⅰ（批號H142）和Col-Ⅲ（批號H144）等ELISA 檢測試劑盒均購于由南京建成生物工程研究所；PMSF（批號ST505）、RIPA 細胞裂解液（批號P0013C）和BCA 蛋白檢測試劑盒（批號P0012S）購自上海碧云天生物技術研究所；PVDF 膜購自美國 Millipore 公司（批號HVLP2932A）；抗MMP-3（批號ab52915）、MMP-9（批號ab38898）、p-IκB-α（批號ab133462）、pp65（批號ab28856）和GAPDH（批號M00227-5）等一抗購于美國Abcam 公司和武漢博士德生物工程有限公司；相應的IgG 購自北京中杉金橋生物有限公司（批號ZF0311）。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞分離和培養［9］在無菌條件下，將BALB／c 小鼠 ［生產許可證號SCXK（豫）2017-0001］骶髂關節軟骨收集在磷酸鹽緩沖液中，清洗3 次，剪成l mm3左右的組織塊，轉入無菌離心管中，加0.05% Ⅱ型膠原酶消化30 min，反復洗滌、離心。然后加入2 g／L Ⅱ型膠原酶溶液及2.5 g／L 胰蛋白酶溶液振蕩消化，置于37 ℃水浴中輕微振蕩消化，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變混濁為止。計數細胞，以1×109／L 的密度接種細胞，每2 d 換液1 次。當原代細胞融合并覆蓋瓶底80%以上時，用2.5 g／L 胰蛋白酶消化，按1 ∶2比例傳代。

1.2.2 細胞處理及分組 用25、50、100 μg／mL金絲桃苷分別處理細胞24 h 后，然后直接用5 ng／mL IL-1β 繼續處理細胞24 h，或單獨用5 ng／mL IL-1β 處理細胞24 h。因而可以將細胞分為5 組，對照組、IL-1β 組、金絲桃苷（25、50、100 μg／mL）組。

1.2.3 MTT 檢測 將細胞接種到96 孔板上，每組設置4 個復孔，分別進行不同處理。然后每孔加入10 μL MTT 試劑（0.5 mg／mL），在培養箱中孵育4 h后棄去培養基，每孔加入150 μL 二甲基亞砜溶液，震蕩溶解15 min，于酶標儀處檢測OD 值。

1.2.4 ELISA 檢測 分別根據試劑盒說明書進行測定。

1.2.5 Western blot 檢測 將細胞接種到24 孔板上，每組設置4 個復孔，分別進行不同處理。每孔加入RIPA 裂解液與PMSF 的混合液（100 ∶1）裂解細胞15 min，離心收集上清提取總蛋白。然后用BCA 蛋白定量試劑盒法測定蛋白樣品濃度，根據標準曲線計算上樣量，然后進行SDS-PAGE 電泳，轉至PVDF 膜，用5% BSA 于37 ℃搖床封閉1 h。隨后進行Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，漂洗3 次（5 min／次）。再將PVDF 膜用相應Ⅱ抗室溫孵育1 h，漂洗4 次（5 min／次）。經Odyssey 紅外激光成像系統掃描，目的蛋白與內參GAPDH 灰度值的比值反映蛋白的表達水平。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.0 統計軟件進行分析，計量資料以（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞活性的影響 分別用0、25、50、100、200 μg／mL 金絲桃苷處理軟骨細胞48 h，MTT 檢測發現，如圖1A 所示，各組細胞活性沒有統計學差異（P＞0.05），說明200 μg／mL 以下的金絲桃苷處理對軟骨細胞無毒性。25、50、100 μg／mL 金絲桃苷處理用于后續實驗。如圖1B 所示，與對照組比較，IL-1β 導致軟骨細胞的活性下降（P ＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞活性降低（P＜0.05）。

圖1 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞活性的影響Fig.1 Effects of hyperin on the chondrocyte viability of mice sacroiliac joint pre-induced with IL-1β

2.2 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞炎性因子的影響 如圖2 所示，與對照組比較，IL-1β 組的IL-6 和TNF-α 水平上調（P ＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的IL-6 和TNF-α 水平上調（P ＜0.05）。

2.3 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞膠原分泌的影響 如圖3 所示，與對照組比較，IL-1β 組的Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平上調（P ＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平上調（P ＜0.05）。

圖2 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞炎性因子的影響Fig.2 Effects of hyperin on the inflammatory cytokines of mice sacroiliac joint chondrocytes pre-induced with IL-1β

圖3 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞膠原分泌的影響Fig.3 Effects of hyperin on the collagen secretion of mice sacroiliac joint chondrocytes inducted with IL-1β

2.4 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞MMPs 的影響 如圖4 所示，與對照組比較，IL-1β 組的MMP-3 和MMP-9 水平上調（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的MMP-3 和MMP-9 水平上調（P＜0.05）。

圖4 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞MMPs 表達的影響Fig.4 Effects of hyperin on MMPs expression of mice sacroiliac joint chondrocytes inducted with IL-1β

2.5 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞NF-κB 通路的影響 如圖5 所示，與對照組比較，IL-1β 組的p-IκB-α 和p-p65 水平上調（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的p-IκB-α 和p-p65 水平上調（P＜0.05）。

圖5 金絲桃苷對IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞NF-κB 通路的影響Fig.5 Effects of hyperin on the NF-κB signaling pathway of mice sacroiliac joint chondrocytes inducted with IL-1β

3 討論

AS 的發病機制至今尚不清楚，主要以中軸脊柱、骶髂關節病變為主［10］，而軟骨細胞損傷是軟骨病變的重要表現［11］。目前，中藥單體化合物治療關節軟骨病變受到越來越多的關注［12］。馬勇等［13］研究表明，姜黃素對軟骨細胞具有一定的保護作用，通過調節Wnt／β-catenin 信號通路促進軟骨細胞的增殖。劉益杰等［14］證實，淫羊藿苷能影響軟骨細胞基質微環境，拮抗IL-1β 誘導的軟骨細胞退變。本研究發現，金絲桃苷能夠通過提高細胞活性、抑制炎性因子和ECM 紊亂抵抗IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞損傷。

作為關節軟骨中唯一的一種細胞成分，軟骨細胞能夠大量地生成和分泌膠原等ECM 組成成分；同時，軟骨細胞也能夠不斷地生成和分泌多種MMPs，降解消化變性、功能異常的ECM 蛋白，從而維持ECM 的合成與分解代謝穩態。研究表明，IL-1β 在改變正常軟骨細胞結構、改變軟骨細胞ECM 方面發揮重要作用。在本研究中，發現IL-1β處理顯著抑制軟骨細胞活性，提高IL-6 和TNF-α水平，降低Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的水平，并上調MMP-3和MMP-9 的表達；而金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的細胞活性下降，IL-6 和TNF-α 水平上升，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平下降，以及MMP-3 和MMP-9 表達上調。以上結果表明，金絲桃苷能夠抵抗IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞的損傷。

NF-κB 是一種具有多種功能的轉錄因子，而IκB 磷酸化將導致其降解，從而暴露出NF-κB 的核識別位點，游離的NF-κB 由此從細胞質轉移進入細胞核，進而調控NF-κB 調控基因的轉錄。研究表明，軟骨細胞損傷與NF-κB 的過度激活密切相關［15］。而金絲桃苷能夠通過抑制NF-κB 信號通路在肺癌、急性肺損傷、肝硬化的治療過程中發揮重要作用［16-18］。在本研究中，發現IL-1β 處理顯著上調p-IκB-α和p-p65 的表達；而金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導的p-IκB-α 和p-p65 的表達上調，表明金絲桃苷能夠通過抑制NF-κB 信號通路的激活來抵抗IL-1β 誘導的小鼠骶髂關節軟骨細胞的損傷。

綜上所述，金絲桃苷能夠抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞活性下降，降低炎性因子水平，并促進ECM 平衡，這與其抑制NF-κB 信號通路有關。本研究提示金絲桃苷可能作為治療軟骨損傷，甚至骶髂關節炎的新藥物，但后期仍需大量的動物實驗研究、臨床研究，為金絲桃苷治療骶髂關節炎提供強有力的理論支持。