一測多評法同時測定辛夷配方顆粒中4 種成分

智雪枝，張 博，田 蘭，劉惠軍，陳 睿

（上海市松江食品藥品檢驗所，上海 201600）

辛夷是木蘭科植物望春花Magnolia biondii Pamp.、玉蘭Magnolia denudate Desr.或武當玉蘭Magnolia sprengeri Pamp.的干燥花蕾，具有散風寒、通鼻竅之功效，用于風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵［1］，其主要化學成分為揮發油、木脂素、生物堿［2-4］，其中木脂素具有抗炎免疫、降壓、影響中樞神經系統、抗菌、抗病毒、抗衰老、殺蟲、抗真菌等作用［5-7］。由于單一有效成分或指標成分的定量分析模式已不能滿足中藥現代化對于質量控制的要求，故曹緯國等［8］建立HPLC 法測定辛夷中辛夷脂素、木蘭脂素的含量，趙鑫等［9］采用HPLC-MS法結合一測多評對辛夷提取物中4 種木脂素含量進行測定，可較好地解決中藥對照品不易獲得，從而對多成分含量測定造成一定局限性的難題。

中藥配方顆粒具有藥性強、藥效好、免煎煮、服用方便等優勢，臨床應用廣泛［10］。本實驗建立一測多評法同時測定辛夷配方顆粒中松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素的含量，以期為該制劑質量的有效控制及后續研究提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters Acquity Arc 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 松脂素二甲醚（18032722，純度99.0%）、表木蘭脂素A（18120328，純度98.14%）對照品均購于上海同田生物技術股份有限公司；木蘭脂素（110882-201607，純度98.4%）、辛夷脂素（111561-200201，純度100%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。辛夷配方顆粒（廠家 A，批號 1612001W、1701001W、1807001W；廠家B，批號18 091131；廠家C，批號7 120412；廠家D，批號A1802324）。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%磷酸，B），梯度洗脫（0～20 min，10%～70% A；20～30 min，70%～90%A；30～32 min，90%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長232 nm（辛夷脂素）、278 nm（松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A）；進樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素對照品適量，用50%甲醇制備成貯備液（四者質量濃度分別為0.506 880、0.588 432、0.487 756、0.053 950 mg／mL），用于線性關系考察。另分別精密稱取4 種對照品7.48、10.08、10.06、10.79 mg，置于20、20、20、200 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，各吸取1.0 mL 至25 mL 量瓶中，50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，用于加樣回收率試驗。

2.2.2 線性溶液 精密吸取“2.2.1”項下貯備液適量，50%甲醇依次稀釋至200、100、50、20、10、20／3、5 倍，即得，編號1～7。

2.2.3 供試品溶液 取顆粒適量，研細，精密稱取0.5 g，置于25 mL 量瓶中，加50% 甲醇約20 mL，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方比例制備缺辛夷的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，色譜圖基線平穩，各成分色譜峰與其他雜質峰均能得到有效分離，分離度大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下線性溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下線性溶液1、4、7，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素峰面積RSD 分別為0.3%、0.4%、0.7%、0.8%（線性溶液1），0.3%、0.3%、0.5%、0.6%（線性溶液4），0.2%、0.2%、0.5%、0.3%（線性溶液7），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 精密稱取同一批顆粒6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素含量RSD 分別為1.2%、1.1%、1.3%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素含量RSD 分別為0.3%、0.4%、0.6%、0.5%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的顆粒0.5 g，置于25 mL 量瓶中，平行9 份，每3份為1 組，按50%、100%、150%水平精密加入對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.9 相對校正因子測定 精密吸取“2.2.2”項下線性溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以木蘭脂素為內標，計算其他3 種成分的相對校正因子fk／s，公式為fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.10 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響 本實驗比較了Waters Acquity Arc、Agilent 1260 色譜儀，以及Kromasil（4.6 mm× 250 mm，5 μm）、Merck RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱對相對校正因子的影響，結果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.11 不同柱溫對相對校正因子的影響 本實驗采用Agilent 1260 色譜儀、Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱考察柱溫25、30、35、40、45、50 ℃對相對校正因子的影響，結果見表5，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.12 不同體積流量對相對校正因子的影響 本實驗采用Agilent 1260 色譜儀、Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱考察體積流量0.7、0.8、0.9 mL／min 對相對校正因子的影響，結果見表6，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表6 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.13 色譜峰定位 以木蘭脂素為內標，計算在“2.10”項儀器、色譜柱下其他3 種成分的相對保留時間，結果見表7，可知均無明顯影響（RSD＜3%）。

表7 各成分相對保留時間Tab.7 Relative retention time of various constituents

2.14 樣品含有量測定 取6 批顆粒，每批3 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，分別采用外標法、一測多評法計算含量，結果見表8。由此可知，2 種方法所得結果接近，相對平均偏差（RAD）＜2.25%。

表8 各成分含量測定結果（μg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 討論

3.1 流動相篩選 本實驗考察了甲醇-水［8-9］、乙腈-水［11］、甲醇-水（含0.1% 甲酸）［12］、甲醇-水（0.1%磷酸）、乙腈-水（0.1%磷酸），發現加入酸后各成分峰形明顯改善。從各成分與相鄰峰的分離情況及其峰形、出峰時間等方面綜合分析，最終選擇乙腈-水（0.1% 磷酸）作為流動相進行梯度洗脫。

3.2 檢測波長篩選 本實驗在200～400 nm 波長處進行紫外-可見吸收光譜掃描，發現松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A 在278 nm 處有較大吸收，而辛夷脂素在232 nm 處有較大吸收。由于辛夷脂素含量較低，并且在此波長處無干擾，故選擇232、278 nm 作為檢測波長。

3.3 提取條件篩選 本實驗考察了不同提取方法（超聲、索氏）、提取時間（30、45、60 min）、提取溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇）對各成分提取率的影響，發現2 種提取方法影響不大，而且在提取過程中對加熱均較穩定；超聲30 min 與超聲45、60 min 的效果相當；50%甲醇、50%乙醇提取效果最佳，其次是75%甲醇、75%乙醇、甲醇、乙醇，但50%乙醇提取出的色譜峰數量較少，不能真實反映辛夷配方顆粒成分。最終，選擇50%甲醇超聲提取30 min 作為提取條件。

4 結論

本實驗建立一測多評法同時測定辛夷配方顆粒中松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素的含量，發現所得結果與外標法無明顯差異，而且該方法在對照品缺少的情況下可實現該成分定量測定，從而對該制劑進行質量控制。