HPLC 法同時測定藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒中4 種成分

何 艷，汪 毅，李 敏，王 惠

（1.湘南學院藥學院，湖南郴州 423000；2.貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550025）

藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒由廣藿香、梔子、防風、南山楂、六神曲、石膏、甘草加工而成，具有清熱化濕、醒脾消滯之功效，臨床上用于治療消化不良、脘腹脹滿等癥。方中廣藿香芳香化濕、醒脾悅胃；梔子、石膏清瀉脾胃積熱，共為君藥；防風疏脾散濕、調脾養胃，為臣藥；南山楂、六神曲消食化滯，為佐藥；甘草調和諸藥，為使藥［1］。目前，對藿香清胃系列制劑的質量控制主要是廣藿香、南山楂的TLC 定性鑒別，部分標準中增加了梔子苷含量測定，但質控指標單一、不一致；相關文獻也僅限于對單一劑型中某一種或某幾種指標成分進行定量測定［2-8］，尚無統一的含量測定方法。因此，本實驗在參照中藥質量標志物原則的基礎上［9］，選擇君藥梔子主要成分梔子苷［10］、臣藥防風主要成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷［11］、使藥甘草主要成分甘草酸［12］作為指標成分，采用HPLC 法同時測定四者含量，以期為該系列制劑質量控制標準的建立提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G1311B 四元泵、G1329B 自動進樣器、G1316A 柱溫箱、G1315D DAD 檢測器（美國安捷倫科技公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XSE-205 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 試劑與藥物 梔子苷（批號110749-201617，純度98.4%）、升麻素苷（批號111522-201511，純度94.8%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號111523-201509，純度95.8%）、甘草酸銨（批號110731-201720，純度97.7%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒共13 批，具體信息見表1。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～15% A；10～25 min，15%～19% A；25～30 min，19% A；30～45 min，19%～45% A；45～50 min，45% A；50～51 min，45%～10%A；51～55 min，10%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長240 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品梔子苷14.52 mg、升麻素苷5.31 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷5.21 mg、甘草酸銨13.74 mg（甘草酸質量＝甘草酸銨質量／1.020 7），分別置于4 個25 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到貯備液，分別精密吸取6、1、1、1 mL，置于同一10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（4 種成分質量濃度分別為342.9、20.14、19.96、52.61 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取片劑10 片（除去薄膜衣或糖衣）、膠囊10 粒（內容物）、顆粒10 袋（內容物），研細，3 種劑型分別精密稱取0.7、0.5、1 g，置于錐形瓶中，精密加入70% 甲醇50 mL，稱定質量，超聲（300 W、40 kHz）處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按片劑處方工藝，分別制備缺梔子、缺防風、缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液中4 種成分色譜峰的分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密量取對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于6 個10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，各精密吸取10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 精密量取對照品溶液5 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得梔子苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸峰面積RSD 分別為0.25%、0.75%、0.46%、1.34%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（批號20191108），于0、6、12、18、24、30 h 在“2.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得梔子苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸峰面積RSD 分別為1.29%、1.54%、1.86%、1.69%，表明供試品溶液在30 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批片劑（批號20191108）、膠囊（批號20200403）、顆粒（批號9J02），按“2.2.2”項下方法各制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣10 μL 測定，測得片劑中梔子苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸含量RSD 分別為0.87%、0.95%、0.84%、1.74%，膠囊中分別為0.41%、1.65%、1.70%、2.48%，顆粒中分別為1.02%、2.79%、2.72%、0.85%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批片劑（批號20191108）適量，研細，取約0.35 g，精密稱定6 份，按100%水平精密加入對照品溶液（0.612 0 mg／mL 梔子苷4 mL、0.150 9 mg／mL升麻素苷1 mL、0.170 1 mg／mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷1 mL、0.132 5 mg／mL 甘草酸4 mL），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算回收率，結果見表3。

2.9 樣品含量測定 取藿香清胃系列制劑，每批精密稱取2 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下各吸取10 μL 進樣測定，計算含量，并折算成每日服用量，結果見表4。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表4 各成分含量測定結果（n＝2）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 討論

3.1 指標成分篩選 本實驗前期曾測定藿香清胃片中另一君藥廣藿香中毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷［13-14］的含量，發現其數值較低，重復性較差，故未納入本實驗中。

3.2 色譜條件篩選 本實驗采用DAD 檢測器在190～400 nm 波長范圍內進行紫外掃描，發現各種成分在240 nm 處均有較大吸收，故選擇其作為檢測波長。參考文獻［7，15-16］報道，本實驗考察了乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸，發現乙腈-0.1% 磷酸梯度洗脫時各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子為1.04～1.10，色譜峰對稱性良好，故選擇其作為流動相。

3.3 提取方法篩選 本實驗比較了不同提取溶劑（100%、70%、50% 甲醇，95%、70%、50% 乙醇）、提取方法（超聲、加熱回流）、提取時間（20、30、40、50 min）對各成分提取率的影響，發現70%甲醇超聲提取30 min 時供試品溶液基線平穩，干擾雜質少，各成分提取量最高，峰形良好，故選擇其作為提取方法。

3.4 含量分析 表1 顯示，藿香清胃片、藿香清胃膠囊、藿香清胃顆粒規格參差不齊，僅憑質量分數不能準確反映各劑型之間的質量差異，故本實驗以每日服用量為依據。結果發現，不同廠家、劑型中各成分每日服用量差異較大，以梔子苷最顯著，高達12 倍。因此，亟需建立藿香清胃系列制劑通用標準，以期確保其臨床療效的穩定性。