UPLC-MS／MS 法同時測定抗萎平異合劑中7 種成分

李玲慧，李 丹，黃漢明，許 文，徐 偉

（1.福州市中醫院，福建福州 350001；2.福建中醫藥大學藥學院，福建福州 350122）

抗萎平異合劑是福建省福州市中醫院用于治療脾胃氣虛、氣滯血瘀、熱毒內蘊所致慢性萎縮性胃炎的院內制劑，由黃芪、黨參、木蝴蝶、蒲公英等十余味中藥組成［1］，具有健脾和胃、理氣活血的功效，臨床療效顯著，對于改善癥狀，減輕或逆轉胃黏膜腺體萎縮、腸化、異型增生及清除HP 均有一定作用［2］。但目前關于抗萎平異合劑的質量控制標準相對薄弱，尤其是缺少含量測定指標，故本實驗在前期研究的基礎上對其進行深入考察。

對于復方質量標準，北京中醫藥大學張世臣教授提出基于全程質量控制理念的工業飲片標準化體系建設研究［3］；中國中醫科學院劉安課題組提出以質量為核心的優質中成藥評價標準研究［4］；天津中醫藥大學劉昌孝院士針對中藥藥效物質與中醫藥基本屬性的基礎研究薄弱，致使質量控制指標與中藥傳統功效的關聯性不強、質量控制指標的專屬性差等共性問題，提出發展中藥質量標志物（Qmarker）理論方法和策略，以期提升中藥科學技術水平［5］。

近年來，UPLC-MS／MS 被越來越多地應用于中藥或復方分析，它具有更高的分離度和靈敏度，有利于多指標成分含量測定，為其合理化質控指標的選擇提供了定性和定量手段［6-8］；另一方面，建立快速定量分析方法（如UPLC 等）可大大節省時間和溶劑，為中藥復方質量標準的提升提供了新技術［9-11］。因此，本實驗通過UPLC-MS／MS 法同時測定抗萎平異合劑中咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸的含量，再結合現代中藥質控理論選擇木蝴蝶苷B 作為Q-marker［12］，通過UPLC-DAD 法對其含量進行測定，以期為該方質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Xevo TQS 三重四級桿質譜、Waters ACQUITY UPLC H-Class（美國 Waters 公司）；CPA225D 型電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius 公司）；KQ-500DE 型臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 咖啡酸（批號 110885-201703）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606）、甘草苷（批號111610-201607）、木蝴蝶苷B（批號111915-201603）、黨參炔苷（批號111732-201607）、黃芪甲苷（批號 110781-200613）、甘草酸（批號110731-201720）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。抗萎平異合劑由福州市中醫院提供，批號180314、180321、180328。乙腈、甲酸為色譜純（德國Merck 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸對照品適量，50%甲醇制備成1 038、1 020、1 162、1 170、904、1011、984 μg／mL 貯備液，精密量取適量，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（各成分質量濃度分別為25.95、25.5、58.1、585、22.6、50.55、246 μg／mL）。另精密稱取木蝴蝶苷B 對照品10.60 mg，置入50 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制成每l mL 含212 μg該成分的貯備液，進一步稀釋成21.20 μg／mL，搖勻，供UPLC 檢測用。

2.1.2 供試品溶液 精密量取合劑1 mL，置于100 mL 量瓶中，加50%甲醇適量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按照處方比例和工藝，制備不含木蝴蝶的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 各成分含量測定（UPLC-MS／MS 法）

每次來送貨卡車時，登子一早守候在營業部大門邊，小阿布硬是跟著來了。甲洛洛每次把小阿布帶在身邊，給他一些自己收藏給兒子們的糖果，有時也帶回家里，把剩菜剩飯熱一下，讓小阿布吃個飽。慢慢的，登子不到營業部卸貨，小阿布也守在營業部大門邊，只要看到甲洛洛出來，便歡叫著撲進甲洛洛懷里：爺爺，我肚子餓！

2.2.1 UPLC 條件 Waters CORTECS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10% A；0.5～4.0 min，10%～30% A；4.0～6.0 min，30%～60%A；6.0～7.0 min，60%～80%A；7.0～7.1 min，80%～10% A；7.1～10 min，10%A）；體積流量0.25 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.2.2 MS 條件 正離子多反應監測（MRM）模式；毛細管電壓3.50 kV；脫溶劑氣氮氣，體積流量800 L／h，溫度500 ℃；錐孔氣氮氣，體積流量150 L／h；離子源溫度150 ℃；二級錐孔萃取電壓3.00 V；碰撞氣氬氣。其他參數見表1，色譜圖見圖1。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液20、50、100、200、400、1 000 μL，置于10 mL 量瓶中，50% 甲醇定容后搖勻，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下測定。以峰面積（Y）對各成分質量濃度（X）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分MS 參數Tab.1 MS parameters for various constituents

圖1 各成分UPLC-MS／MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.2.3.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下測定，測得各成分日內精密度RSD 分別為咖啡酸4.4%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷3.5%、甘草苷3.2%、木蝴蝶苷B 1.3%、黨參炔苷4.4%、黃芪甲苷2.7%、甘草酸2.5%；日間精密度RSD 分別為咖啡酸4.0%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷4.1%、甘草苷2.2%、木蝴蝶苷B 1.4%、黨參炔苷4.2%、黃芪甲苷2.2%、甘草酸1.4%，表明儀器精密度良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.2.3.3 穩定性試驗 取合劑（批號180314）1 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣測定，測得各成分峰面積RSD 分別為咖啡酸3.4%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷4.2%、甘草苷2.3%、木蝴蝶苷B 1.1%、黨參炔苷4.1%、黃芪甲苷2.8%、甘草酸1.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取合劑（批號180314）6 份，每份0.5 mL，按1 ∶1 比例分別加入對照品溶液，其中咖啡酸（1 038 μg／mL）25 μL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（1 020 μg／mL）30 μL、甘草苷（1 162 μg／mL）100 μL、木蝴蝶苷B（1 170 μg／mL）800 μL、黨參炔苷（904 μg／mL）15 μL、黃芪甲苷（1 011 μg／mL）45 μL、甘草酸（984 μg／mL）50 μL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結果，咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸平均加樣回收率分別為97.53%、104.30%、98.45%、98.08%、99.31%、102.31%、97.77%，RSD 分別為4.2%、3.6%、4.0%、4.3%、3.3%、3.3%、3.8%。

2.2.4 樣品含量測定 取合劑（批號180314）1 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”“2.2.2”項條件下測定，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果Tab.3 Results of content determination of various constituents

2.3 木蝴蝶苷B 含量測定（UPLC-DAD 法）

2.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10%A；0.5～10 min，10%～18% A；10～15 min，18%～25%A；15～15.1 min，25%～10%A；15.1～20 min，10% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長276 nm；進樣量5 μL，色譜圖見圖2。由此可知，木蝴蝶苷B 與其他色譜峰分離度良好，理論塔板數按該成分計不低于5 000。

圖2 木蝴蝶苷B UPLC-DAD 色譜圖Fig.2 UPLC-DAD chromatograms of baicalein-7-O-gentiobioside

2.3.2 線性關系考察 取“2.1.1”項下貯備液，制成含 1.060、2.120、4.240、8.480、16.96、33.92 mg／L 木蝴蝶苷 B 的對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以木蝴蝶苷B質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝35.20X-2.528（r＝0.999 8），在1.060～33.92 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.3.3 重復性試驗 取合劑（批號180314）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得木蝴蝶苷B含量RSD 為1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 精密度試驗 在同一個實驗室內3 個分析人員用同一臺儀器，按“2.3.3”項下方法測定，測得木蝴蝶苷B 含量RSD 為1.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 取合劑（批號180314）1 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得木蝴蝶苷B 峰面積RSD 為1.9%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率實驗 精密量取9 份合劑（180314），每份0.5 mL，分為3 組，每組3 份，分別加入木蝴蝶苷B（212.0 μg／mL）對照品溶液2.3、4.2、6.4 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 木蝴蝶苷B 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab.4 Results of recovery tests for baicalein-7-O-gentiobioside（n＝3）

2.4 樣品含量測定 取3 批合劑，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表5。

表5 木蝴蝶苷B 含量測定結果（n＝3）Tab.5 Results of content determination of baicalein-7-Ogentiobioside（n＝3）

3 討論

3.1 指標成分篩選 本實驗以現代中藥質控理論和2020 年版《中國藥典》 一部為指導，根據其中各味中藥飲片含量測定的指標成分進行篩選。根據含量測定結果結合Q-marker 理論，發現抗萎平異合劑中木蝴蝶苷B 含量最高，而且現代藥理研究表明它具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性［13-15］，能通過抗胃炎、抑制幽門螺旋桿菌、抗胃炎氧化應激等途徑調和脾胃［16］，是評價木蝴蝶質量的重要Q-marker［17-19］，也可能是復方功效的重要物質基礎之一，故選擇其作為指標成分。

3.2 檢測波長篩選 本實驗采用DAD 檢測器在190～400 nm 波長范圍內的紫外吸收光譜進行全波長掃描，發現木蝴蝶苷B 最大吸收波長為276 nm，故選擇其作為檢測波長。

3.3 流動相篩選 參考文獻［20］報道，本實驗考察了甲醇-水、甲醇-水（含0.1% 甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1% 甲酸），發現乙腈-水（含0.1%甲酸）洗脫時木蝴蝶苷B 分離效果明顯更優，出峰時間適宜，峰形較好，基線穩定，能達到系統適用性的要求，故選擇其作為流動相。

3.4 耐用性考察 本實驗考察了Agilent1290、Waters ACQUITY UPLC H-Class、Waters ACQUITY UPLC I-Class 高效液相色譜儀，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Thermo syncronis aQ C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Ultimate UHPLC XB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相0.05%甲酸、0.10%甲酸、0.15%甲酸，體積流量0.25、0.30、0.35 mL／min，柱溫25、30、35 ℃，發現不同條件下木蝴蝶苷B 含量RSD 均小于2%，表明該方法耐用性良好。

4 結論

本實驗首先通過UPLC-MS／MS 法同時測定抗萎平異合劑中咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、木蝴蝶苷B、黨參炔苷、黃芪甲苷、甘草酸的含量，在此基礎上結合含量測定結果與活性分析，篩選出木蝴蝶苷B 作為指標成分，建立UPLC-DAD法測定其含量，可為該方質量控制提供參考。

致謝：本項目在福建省科技廳重點實驗室、福建省中藥資源研究與開發利用重點實驗室完成。