PGP基因家族成員的結構和功能1)

李洋 刁健 郝昕 馬玲

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

松樹是目前世界上最重要的木材來源物種之一，它在生態、社會和經濟等方面的價值也得到了極高程度地認可，其作為典型綠化樹種[1]，在人類的生活中扮演著重要的角色[2-3]。自然界中松樹的主要威脅之一是來自松材線蟲的侵害[4-5]。對松樹枯萎病(Bursaphelenchusxylophilus)的防控主要運用下列幾種方法[6-8]：殺蟲劑的空中噴灑、藥物熏蒸、病樹的人工清除等。結合實踐結果分析可知，合成殺蟲劑的使用可能會產生環境污染、人類健康受損以及非目標生物破壞等惡性影響[9]。目前為止，注射植物殺線蟲劑(主要是阿維菌素類化合物)的防控方法較為安全[10]，可以使松樹免受線蟲的感染。

多種化合物(例如內源性物質、藥物或其他異源生物等)不能通過被動擴散滲透，他們的生物利用度取決于吸收和外排轉運蛋白之間的互相平衡，這些蛋白能夠促進生物中的底物在膜上的運動[11-13]，且它們在維持細胞穩態和釋放潛在有毒物質的生物過程中，起著重要的作用[11-12]。研究表明，有一種針對農藥的防御機制與上述作用相似，即由環境污染物積累所引起的毒性保護過程，它們作用的發生與哺乳動物、昆蟲以及植物中的外排轉運蛋白有關[14-15]。ABC載體可以有效地將有害內源物質以及各種與生長過程無關的外源物質(包括藥物等)從細胞中排出，并且能夠在生理學、藥理學和毒理學等領域中發揮重要作用。此外，ABC載體可以與藥物代謝酶發揮協同作用，從而保護生物體免受有毒化合物的侵害[16]。ABC轉運蛋白參與了多藥耐藥性的發展，其作用特點是通過降低細胞內的藥物濃度，從而阻止各種惡性疾病的成功治療[15，17-21]。涉及多藥耐藥性作用的主要成員分布在ABCB、ABCC、ABCG及其他亞家族。不同成員的表達之間沒有相關性，但它們可以在多藥耐藥的作用過程中發揮協同作用。本研究中涉及到的蛋白質屬于ABCB亞家族。

P糖蛋白(PGP)賦予生物的抗藥耐藥屬性只在一部分基因中表現了出來[12，21-22]。ABC轉運蛋白的誘導劑和激活劑分別具有增強外排轉運蛋白表達水平和活性的能力[23]，因而潛在有害化合物進入特定靶組織的機會有所降低。目前為止，關于PGP家族的基因成員已得到了廣泛研究，如MDR1(編碼PGP的基因)中的多個單核苷酸多態性作用[24]。對PGP家族所展開的研究主要是關于以下方面：PGP家族涉及到的不同種類神經退行性疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森癥和癲癇病[25-26]等。這種ABC轉運蛋白積極參與了生理和病理過程，本課題組主要關注其外排功能的調節。基于以上研究現狀可知，有關松材線蟲PGP家族的耐藥性研究較為有限，這導致有關植物寄生線蟲抗性和代謝過程的研究進展緩慢。因此，本研究運用生物信息學手段，分析了Bx-PGP家族中部分成員的蛋白質結構和功能，旨在為日后線蟲農藥的開發，以及新型預防技術的拓展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 Bx-pgp基因家族成員進化關系及理化特性測定

為了了解松材線蟲PGP家族成員信息，從NCBI網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了相應的氨基酸序列。使用MEGA 5.1軟件[27]對氨基酸進行了多序列比對，并在此基礎上構建了系統進化樹。在構建系統進化樹時，相關參數設置如下：鄰接法(NJ)采樣泊松模型，樣本的bootstrap為1 000次迭代。

為了進一步驗證各蛋白質成員間的進化關系，使用最大似然法(ML)構建[27]系統進化樹。從Pfam數據庫(http：//pfam.xfam.org/)[28]中獲得了Bx-PGP家族中相關基因的DNA結合結構域序列，隨后進行了多序列比對。用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)對蛋白質的理化性質進行預測，包括氨基酸數量、相對分子質量、理論等電點值、脂肪系數、親水性、分子式、總原子數和不穩定系數[29]。

1.2 蛋白質序列基序分析

通過MEME (http://meme-suite.org/) 方法對蛋白質序列的基序進行分析，基序序列的功能通過Pfam 數據庫獲得 (http://pfam.xfam.org/)。

1.3 疏水性和跨膜螺旋區域分析

通過ExPASy ProtScale網站(https：//web.expasy.org/protscale/)對蛋白質的疏水性進行分析。利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[30]對蛋白質的跨膜區域進行分析。

1.4 拓撲異構模型預測

使用Protter網站(http：//wlab.ethz.ch/protter/start/)對蛋白質的拓撲異構模型進行預測[31]。

2 結果與分析

2.1 Bx-pgp基因家族的鑒定及其理化性質

從基因組中鑒定了10個Bx-pgp基因成員，并以Bx-pgp1至Bx-pgp10的順序命名了各基因(表1)。由表1可知，10個相應蛋白質的長度和相對分子質量參數有著顯著的不同。氨基酸個數為124～1 417，平均長度為794.9 。相對分子質量為13 388.16～160 462.04，平均為89 135.88。這些蛋白質的理論等電點為5.39～9.21，脂肪系數為93.26～109.36。可見，這些蛋白質的熱穩定性發生了顯著變化。蛋白質親水性系數為-0.236～0.276，除了Bx-pgp3，Bx-pgp6，Bx-pgp9，Bx-pgp10以外，其他蛋白質的系數值均為正數，表明上述4種蛋白質為親水蛋白，其他6種蛋白是疏水蛋白。這些蛋白質都包含C、H、N、O和S 5個原子。原子總數為1 891～22 794個。蛋白質不穩定系數為29.48～42.30，其中Bx-pgp3和Bx-pgp10的指數大于40，表明它們的蛋白質結構不穩定，而其他8種蛋白質的指數均小于40，表明其結構穩定。

表1 Bx-pgp蛋白質理化性質

2.2 系統發育進化樹及蛋白質基序

通過構建NJ系統發育進化樹(圖1A)初步揭示了Bx-PGP部分家族成員的進化關系，并以bootstrap重采樣測試作為該結果的可靠性基礎。為了進一步揭示NJ模型的可靠性，使用JTT + G + F模型構建了ML系統發育進化樹(圖1B)。由2種發育進化樹的結果綜合比較可知，這2種模型下的分析結果具有非常好的一致性。

由表2可見，與預期相同，Bx-PGP家族中的蛋白質，特別是那些具有相似進化關系的蛋白質，均含有相同或相似的蛋白質保守結構域。通過運用MEME方法對序列的詳細分析，得到了15個保守的蛋白質序列基序。隨后，通過Pfam和InterProScan對蛋白質序列基序進行分析，結果表明，基序1和基序3具有ABC轉運蛋白結構域，基序5、6、11具有ABC轉運蛋白跨膜螺旋結構域，其他基序序列沒有詳細的功能注釋。

圖1 Bx-pgp部分家族成員的系統發育進化樹

表2 Bx-PGP蛋白質序列基序分析

根據Pfam網站對各蛋白質序列的結構分析可知，關注的Bx-PGP家族成員中的蛋白質，除Bx-PGP6外，都具有ABC轉運蛋白結構域，這表明他們可能都具有一定程度的轉運功能。除基序1、4、6、9、10外,各蛋白序列均具有ABC轉運蛋白跨膜螺旋區域。但Bx-pgp6不含有任何已被注釋的基序序列(圖2)。

圖2 Bx-PGP蛋白質保守結構域分析

2.3 蛋白質疏水性

蛋白質疏水性分析結果以Bx-PGP1為例對結果進行說明。Bx-PGP1蛋白中的第694位天冬氨酸(D)具有-2.978的低疏水性評分，由此可知它具有很高的親水性。相反，第230位的異亮氨酸(I)具有3.489的較高疏水性得分，表明其更具有疏水性。表3中列出了該家族中10個氨基酸序列的疏水性分析結果，由該結果可知，該家族中的蛋白質包含多個親水性和疏水性區域，但是他們的分布和聚集現象并不顯著。

表3 Bx-PGP疏水性

2.4 跨膜螺旋區域

使用TMHMM網站預測了Bx-PGP基因家族成員的跨膜螺旋區域。結果以Bx-PGP1為例(圖3)。通過分析結果可知，Bx-PGP4蛋白具有最多的跨膜螺旋區域片段，共計16個。相反地，Bx-PGP6蛋白不含跨膜螺旋區域片段。在其余的8個蛋白質序列中，跨膜螺旋區域的長度和片段數各不相同。下面以Bx-PGP1為例，簡要描述該蛋白質序列中跨膜螺旋區域的分析結果。在Bx-PGP1蛋白序列中，12個跨膜螺旋區域片段的起止位置分別是64～86、123～145、195～213、217～239、298～320、325～347、726～748、774～796、854～871、875～897、958～980和990～1 012；膜外部分的起止位置分別是87～122、214～216、321～324、749～773、872～874和981～989；相反，膜內部分的起止位置分別是1～63、146～194、240～297、348～725、797～853、898～957和1013～1291。表4列出了其他9個蛋白質序列跨膜螺旋區域片段的詳細信息。

圖3 Bx-PGP基因家族成員的跨膜區域預測結果

2.5 拓撲異構模型預測

該家族中基因的拓撲預測結果以Bx-PGP為例(圖4)。由圖4可知，該家族中Bx-PGP3具有最多的N-糖基化位點，共計有8個。相反，Bx-PGP6沒有N-糖基化位點。表5中顯示了該家族中其他9個蛋白質的拓撲異構分析結果。其中，由于分析模型及算法的差異，跨膜螺旋數量上會出現個別與前文不同的結果。研究表明，N-糖基化位點的存在對于蛋白質的折疊和運輸非常重要。因此，該預測結果可以從另一個角度證實筆者的假設，即Bx-PGP家族成員的耐藥性與藥物流出密切相關。

1～12表示跨膜螺旋的數量。

表4 Bx-PGP基因家族成員的跨膜區域

表5 Bx-pgp蛋白拓撲異構分析結果

3 結論與討論

松材線蟲的隱蔽性特征使得其與寄主間的關系極為復雜[4，32]。正因為有效控制方法的缺乏，使得它們給林業領域帶來了不可預估的損失。研究可知，效果顯著且成本較低的一種方法是對潛在目標的發現和利用[32-33]。真核生物中的PGP家族成員，可以將外源物質從細胞中去除，例如有效降低細胞中的藥物濃度，這在生物體對藥物的耐受反應過程中起著極其重要的作用。隨著生物耐藥性研究進展的不斷推進，PGP家族成員在耐藥性和新陳代謝等方面的作用也得到了廣泛關注[16]。植物寄生性線蟲的抗藥代謝反應過程是抵抗藥物的主要途徑，因此，對于松材線蟲PGP家族成員功能的研究，將為新型防治技術手段的開發提供理論依據。

本研究對松材線蟲PGP基因家族成員進行了多種類型的生物信息學分析。先后運用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)構建了Bx-PGP家族成員的系統進化樹，從而比較PGP家族中各成員的相似性。通過TMHMM方式對Bx-PGP家族各成員的蛋白序列結構進行預測，結果表明各成員編碼的蛋白質，包含了多個跨膜結構域(TMD)和核苷酸結合域(NBD)，因此推測該蛋白家族成員具有物質運輸的功能，并具有與其他蛋白及大分子化合物相結合的屬性[34]。由于親水和疏水蛋白的平衡在蛋白質的結構和功能中起著重要作用，因而，本研究通過對蛋白質疏水性分析的探討，分析了Bx-PGP家族成員的結構特點。蛋白質的轉移和定位與其自身結構有著緊密的聯系，拓撲異構分析結果可以更直觀地了解PGP家族成員，且分析結果更易理解。此外，也可以通過此方法對N-糖基化位點進行預測。N-糖基化位點的存在對蛋白質的折疊和運輸起著重要作用，這也可以從另一個角度證實筆者的假設，即Bx-PGP家族成員的耐藥性與藥物流出有著密切聯系。基于對蛋白質疏水性、跨膜螺旋區域和N-糖基化位點等性質的分析可知，特殊結構的存在可以實現藥物的胞外轉運。因此，可以得出這樣一個結論，Bx-PGP基因家族所表現出的耐藥性可能與其促進藥物外排有關，但是其在多藥耐藥過程中的功能機制仍需要進一步的試驗探索。

截至目前，有關松材線蟲PGP家族成員耐藥性的報道較少。本研究的結果表明，松材線蟲PGP家族成員可能是控制這種寄生線蟲破壞植物能力的潛在靶標。然而，與松材線蟲抗性相關的其他基因和途徑，仍需進一步的探索與發現。本研究的主要目的在于開發一種以Bx-PGP蛋白家族為生物防治靶標的藥物協同劑，并為證明其防治效果提供理論依據。