中國典型土壤中鉛的生物可給性的影響因素分析與健康風險評估

陳曉晨 ，韓澤亮，張劍宇，黃振佳，尹乃毅，劉憲華，刁國旺，徐開欽

1.福州大學環(huán)境與資源學院/福建省農(nóng)村廢棄物綠色循環(huán)技術(shù)工程研究中心，福建 福州 350108；2.江蘇隆昌化工有限公司，江蘇 如皋 226532；3.中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 101408；4.天津大學環(huán)境科學與工程學院，天津 300072；5.揚州大學化學化工學院，江蘇 揚州 225002；6.日本國立環(huán)境研究所資源循環(huán)廢棄物研究中心，筑波 305-8506

鉛（Pb）是一種廣泛存在的重金屬元素，而采礦、冶煉、含鉛燃料燃燒以及農(nóng)業(yè)化學品的不當使用等一系列的人為活動導致嚴重的土壤鉛污染，成為世界范圍內(nèi)的關(guān)注焦點（秦鵬等，2014）。作為一種毒性較強的非必需元素，鉛可通過食物鏈、直接經(jīng)口部攝入、呼吸以及皮膚接觸等途徑進入人體，進而對神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)等造成損害（Zhou et al.，2020）。由于各國對食物鏈等暴露途徑進行了嚴格管控，對于長期從事戶外工作卻缺乏防護的人員以及衛(wèi)生意識較淡薄的兒童而言，口部攝入已成為其鉛攝入的最主要途徑（Li et al.，2015a；Lin et al.，2017）。為及時遏止土壤污染及其危害的擴大化，近年來中國頒布了《土壤污染防治行動計劃》（“土十條”）及《土壤污染防治法》等里程碑式的法規(guī)文件。積極開展土壤環(huán)境質(zhì)量狀況調(diào)查評估、準確掌握土壤鉛等污染物的健康風險信息，具有重要的科學價值和社會意義。

目前，土壤污染物的健康風險評估方法大多仍是基于其重金屬質(zhì)量分數(shù)，包括中國新近發(fā)布的《土壤環(huán)境質(zhì)量建設(shè)用地土壤污染風險管控標準》（GB 36600—2018）（生態(tài)環(huán)境部，2018）以及美國推薦的人體健康風險評估模型（USEPA，2007；USEPA，1991）等均是如此。然而，由于實際經(jīng)口部攝入的土壤污染物并不會 100%被人體消化吸收進而進入體循環(huán)，這些方法往往導致對健康風險的過高估計（Liang et al.，2016）。近年來，基于土壤污染物的生物可給性（bioaccessibility）來更為精確地評估其對人體健康風險的體外試驗（in vitrotest）方法學得到長足發(fā)展，其可通過在體外模擬人體消化系統(tǒng)，獲取攝入人體的土壤鉛在胃腸道中溶出的百分比（即鉛的生物可給性）信息，掌握人體所能吸收的鉛的最高值（Ruby et al.，1996）。已見報道的體外試驗?zāi)Ｐ陀泻芏啵≧uby et al.（1996）提出的PBET（Physiologically Based Extraction Test）模型、Rodriguez et al.（1999）提出的IVG（In Vitro Gastrointestinal）模型、DIN（2000）提出的 DIN（Deutsches Institut füer Normung）模型、Wragg et al.（2011）提出的 UBM（unified BARGE method）模型等。因提出較早、與動物試驗（invivotest）結(jié)果相關(guān)性好、應(yīng)用廣泛，PBET和 IVG模型被公認為研究土壤鉛的生物可給性的最適宜的體外試驗?zāi)Ｐ椭↙i et al.，2017；Juhasz et al.，2016）。

隨著體外試驗?zāi)Ｐ捅粡V泛應(yīng)用于健康風險評估，探索土壤鉛等重金屬污染物的生物可給性的影響因素成為該領(lǐng)域的熱點，而以往的研究主要涉及了多種土壤理化性質(zhì)以及鉛的賦存形態(tài)。在土壤理化性質(zhì)方面，pH和有機質(zhì)報道較多。Van de Wiele et al.（2007）發(fā)現(xiàn)土壤pH對鉛的生物可給性影響并不顯著，而鄭順安等（2013）的研究卻表明土壤pH的提高可顯著降低鉛的生物可給性，Du et al.（2019）更是認為可以通過土壤pH實現(xiàn)對鉛的生物可給性的預(yù)測。De Miguel et al.（2012）發(fā)現(xiàn)土壤有機質(zhì)可以作為預(yù)測鉛的生物可給性的指標之一，Saminathan et al.（2010）的研究表明較高的有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)可顯著降低鉛的生物可給性，而羅梅等（2020）發(fā)現(xiàn)土壤中小分子量的腐殖酸可有效提高鉛的生物可給性。此外，土壤質(zhì)地（Ma et al.，2019；Zong et al.，2016）、陽離子交換量（Yan et al.，2019；Wijayawardena et al.，2015）、無定形鐵錳氧化物（Yang et al.，2002；尹乃毅等，2014）以及鉛的 CaCl2提取態(tài)（Mahar et al.，2015；李巖等，2019）等都曾被報道為可能是土壤鉛的生物可給性的影響要素，盡管所得研究結(jié)論亦不盡相同。在鉛的賦存形態(tài)方面，經(jīng)典的Tessier連續(xù)提取法（Tessier et al.，1979）及其若干改進版均是解析土壤鉛化學形態(tài)的重要技術(shù)手段。Ai et al.（2019）發(fā)現(xiàn)土壤鉛的可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)與其生物可給性顯著相關(guān)，而Li et al.（2015b）的研究則進一步發(fā)現(xiàn)鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)同樣與其生物可給性關(guān)系密切。盡管前人在土壤理化性質(zhì)、鉛的賦存形態(tài)與土壤鉛的生物可給性之間的關(guān)系方面做了大量研究工作，但仍然得到了很多無定論甚至是相互矛盾的結(jié)論。究其原因，一方面，這些研究多只針對區(qū)域性的或隨機的、個別的土壤樣品，未能在較大空間尺度上涵蓋多種代表類型土壤，其結(jié)果具有明顯的局限性；另一方面，以往的研究多僅針對若干影響因素獨立地進行探究，缺乏對各類可能影響因素的全面綜合的系統(tǒng)性研究。

綜上所述，本研究針對人工制備鉛污染的紅壤、褐土、黑土、棕壤和黃壤這五種中國典型土壤，結(jié)合體外試驗方法（改進的 PBET模型），精確獲知其經(jīng)口部途徑攝入人體后鉛的生物可給性及相應(yīng)的健康風險，進而從土壤理化性質(zhì)和鉛的賦存形態(tài)角度，全面綜合地探討其對土壤鉛的生物可給性的影響。相關(guān)研究成果將為今后在中國開展大范圍的實地鉛污染土壤健康風險評估工作提供準確的科學依據(jù)與有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 鉛污染土壤的制備

采集紅壤（福建）、褐土（北京）、黑土（黑龍江）、棕壤（江蘇）及黃壤（湖南）這五種中國典型土壤，風干、磨碎，過2 mm篩后待用。根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量建設(shè)用地土壤污染風險管控標準》（GB 36600—2018）一類用地管制值，采用人工摻混[Pb(NO3)2]的方式（Tang et al.，2008），制備成鉛質(zhì)量分數(shù)為800 mg·kg?1的污染土壤。其間，保持各土壤含水率約30%（Zhang et al.，2015），培養(yǎng)1個月。之后，將其風干、磨碎，過2 mm和0.15 mm篩。其中過2 mm篩的用于土壤pH、質(zhì)地（粘粒質(zhì)量分數(shù)）及CaCl2提取態(tài)鉛質(zhì)量分數(shù)測定，過0.15 mm篩的用于土壤有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、陽離子交換量、無定形鐵錳氧化物質(zhì)量分數(shù)測定，以及鉛的賦存形態(tài)分析和體外試驗。每個分析項目均重復3次。

1.2 鉛污染土壤性質(zhì)分析

1.2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤pH采用CaCl2提取法，土液比為1∶2.5，pH計（PHS-3C，雷磁，中國）測定（魯如坤，2000）12-13。有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)采用水合熱 K2Cr2O7比色法測定（魯如坤，2000）109-110。質(zhì)地（粘粒質(zhì)量分數(shù)）采用比重計法，甲種比重計測定（魯如坤，2000）282-284。陽離子交換量采用BaCl2提取法（Hendershot et al.，1986）；無定形鐵錳氧化物質(zhì)量分數(shù)采用H2C2O4-(NH4)2C2O4提取法（Klute，1986）；CaCl2提取態(tài)鉛質(zhì)量分數(shù)采用CaCl2溶液浸提（Pueyo et al.，2004）；上述提取液中金屬元素質(zhì)量濃度測定使用ICP-OES（Optima，美國）。

1.2.2 土壤鉛的賦存形態(tài)

（1）改進的Tessier連續(xù)提取法（Tang et al.，2008）

該方法將土壤中鉛區(qū)分為水溶態(tài)（F1）、可交換態(tài)（F2）、碳酸鹽結(jié)合態(tài)（F3）、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)（F4）、有機結(jié)合態(tài)（F5）和殘渣態(tài)（F6）。每個形態(tài)的提取液經(jīng)離心和0.45 μm膜過濾，其鉛質(zhì)量濃度測定使用 ICP-MS（ThermoFisher，X SERIES II，美國）。

（2）遷移系數(shù)

F1、F2、F3的鉛在土壤中有較強的遷移能力，通常被認為是可能對環(huán)境造成較嚴重危害的賦存形態(tài)。Taghlidabad et al.（2018）用遷移系數(shù)（mobility factor）表征其在土壤總鉛中的比例，本文中由于涉及方法學引入了鉛的水溶態(tài)故將其公式在此基礎(chǔ)上定義如下：

1.3 體外試驗

1.3.1 實驗方法

采用PBET模型（Ruby et al.，1996），并參考IVG模型（Rodriguez et al.，1999）進行改進，模擬人體胃腸道的消化過程，具體步驟如下：

胃階段：每批樣品配置 1 L胃液（其中包含8.775 g氯化鈉、0.50 g檸檬酸、0.50 g蘋果酸、0.42 mL 乳酸和 0.50 mL 冰乙酸），用 12 mol·L?1濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5，加1.25 g胃蛋白酶（Porcine Pepsin P 7000，Sigma-Aldrich，美國）。分別稱量0.3 g過0.15 mm篩鉛污染土壤至兩根50 mL聚丙烯錐形離心管中，各加入30 mL模擬胃液，置于恒溫震蕩儀中，在 37 ℃、150 r·min?1條件下振蕩 1 h后取出其中一根離心管。用一次性注射器吸取 10 mL反應(yīng)液，0.45 μm膜過濾，4 ℃保存待測，采用ICP-MS測定鉛質(zhì)量濃度。

小腸階段：進一步向胃階段剩余的另一根 50 mL聚丙烯錐形離心管中加入NaHCO3粉末，將反應(yīng)液 pH調(diào)至 7.0，加入 0.018 g胰酶（Porcine Pancreatin P1500，Sigma-Aldrich，美國）和0.06 g膽鹽（Bile Extract B8631，Sigma-Aldrich，美國），在與胃階段相同的溫度和振蕩條件下繼續(xù)反應(yīng) 4 h。其間，間隔30 min測定反應(yīng)液pH值，若偏離中性條件，則用 12 mol·L?1的濃 HCl或 NaHCO3粉末微調(diào)。用一次性注射器吸取10 mL反應(yīng)液，0.45 μm膜過濾，4 ℃保存待測，采用 ICP-MS測定鉛質(zhì)量濃度。

1.3.2 土壤鉛的生物可給性計算

式中，fBAC為土壤鉛的生物可給性（%）；ρiv是胃或小腸階段消化液中生物可溶態(tài)鉛的質(zhì)量濃度（mg·L?1）；viv為胃或小腸階段反應(yīng)液的體積（L），本實驗為 0.03 L；ωs是土壤中鉛質(zhì)量分數(shù)（mg·kg?1），本實驗為 800 mg·kg?1；ms為土壤質(zhì)量（kg），本實驗為0.0003 kg。

1.3.3 土壤鉛對人體的健康風險評估

采用 USEPA推薦的人體健康風險評估模型（USEPA，2007；USEPA，1991），并基于體外試驗獲得的鉛的生物可給性值對公式進行修正，以實現(xiàn)對土壤鉛的非致癌風險更加準確的評估，公式如下：

式中，HQ為土壤鉛的非致癌風險，若超過 1則表示該土壤可能引發(fā)不良健康效應(yīng)；CDIm為經(jīng)口部攝入鉛的日均暴露劑量（mg·kg?1·d?1）；fBAC為土壤鉛在胃或小腸階段的生物可給性（%）；RfD為經(jīng)口部攝入鉛的參考劑量（mg·kg?1·d?1），為3.5×10?3mg·kg?1·d?1；ωs為土壤中鉛質(zhì)量分數(shù)，本實驗為 800 mg·kg?1；ImR為每日土壤攝入量（mg·d?1），兒童為 200 mg·d?1，成人為 100 mg·d?1；CF為單位轉(zhuǎn)換因子，為 10?6；EF為暴露頻率（d·a?1），為 350 d·a?1；ED 為暴露持續(xù)時間（a），兒童為6 a，成人為30 a；BW為人體質(zhì)量（kg），兒童為16.2 kg，成人為61.8 kg；AT為平均暴露時間（d），為 ED×365 d。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析，Origin 9.1進行圖表繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤鉛的生物可給性及其健康風險

2.1.1 土壤鉛的生物可給性

胃和小腸階段土壤鉛的生物可給態(tài)質(zhì)量分數(shù)及生物可給性見圖1。胃階段土壤鉛的生物可給性為72.7%—82.6%，小腸階段為22.8%—27.7%，前者極顯著高于后者（P＜0.01）。這與付瑾等（2012）的研究結(jié)果一致，主要是由于從胃階段進入小腸階段后 pH急劇升高且伴隨著 CO32?質(zhì)量濃度增加，致使胃階段溶出進入消化液中的鉛發(fā)生了沉淀或重吸附到土體上（鄭順安等，2013）。該現(xiàn)象涉及的機理可能較為多樣，在小腸階段的中性pH條件下，鉛自身的沉淀作用可能是主導，而鐵的沉淀物及其氧化物對鉛的再吸附以及土壤有機質(zhì)更易于將鉛絡(luò)合等都可能發(fā)揮重要作用（Li et al.，2020；Yang et al.，2006）。此外，胃階段不同土壤間鉛的生物可給性存在極顯著差異（P＜0.01），而小腸階段不同土壤間鉛的生物可給性無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 土壤鉛在胃階段與小腸階段的生物可給態(tài)質(zhì)量分數(shù)/生物可給性Fig.1 Bioaccessible concentration/bioaccessibility of soil Pb in gastric and small intestinal phases

2.1.2 土壤鉛的健康風險

經(jīng)口部攝入的土壤鉛對人體的非致癌風險見表1。

表1 經(jīng)口部攝入的土壤鉛對人體的非致癌風險Table 1 Non-carcinogenic risks of soil Pb through oral ingestion

在胃階段，5種土壤鉛對成人和兒童的非致癌風險范圍分別為0.26—0.29和1.97—2.23，后者極顯著高于前者（P＜0.01），平均達到前者的7.6倍，且各土壤鉛對兒童的非致癌風險均超過可接受限值1，平均達到2.1倍。不同土壤間鉛對人體的非致癌風險存在極顯著差異（P＜0.01）。

在小腸階段，5種土壤鉛對成人和兒童的非致癌風險范圍分別為0.08—0.10和0.62—0.75，后者極顯著高于前者（P＜0.01），平均達到前者的7.6倍，但二者均未超過可接受限值1。不同土壤間鉛對人體的非致癌風險無顯著差異（P＞0.05）。

此外，與前述土壤鉛的生物可給性的結(jié)果相同，無論對于成人還是兒童而言，在胃階段土壤鉛的非致癌風險極顯著高于小腸階段（P＜0.01），在人體最主要的消化和吸收器官（小腸）中鉛的非致癌風險平均降低了67.5%，而該現(xiàn)象還導致鉛的非致癌風險的土壤間差異不復存在了。

2.2 土壤鉛的生物可給性的影響因素

2.2.1 土壤理化性質(zhì)

鉛污染土壤的理化性質(zhì)見表2。

表2 鉛污染土壤的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of Pb-contaminated soils

土壤理化性質(zhì)與土壤鉛的生物可給性之間的相關(guān)性見表3。在胃和小腸階段，土壤pH和有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)均與土壤鉛的生物可給性呈高度顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

表3 土壤理化性質(zhì)與土壤鉛生物可給性之間的相關(guān)性Table 3 Correlations between soil physiochemical properties and bioaccessibility of soil Pb

2.2.2 土壤鉛的賦存形態(tài)

土壤鉛的各賦存形態(tài)及其占總鉛的百分比見圖2。遷移系數(shù)的排序為紅壤 (73%)＞棕壤 (38%)＞褐土(36%)＞黃壤 (30%)＞黑土 (17%)，平均為 39%。不同土壤間遷移系數(shù)存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 土壤鉛的賦存形態(tài)及其占總鉛的比例Fig.2 Fractions of soil Pb and their proportions to the total Pb

遷移系數(shù)與土壤鉛的生物可給性之間的相關(guān)性見表4。在胃和小腸階段，遷移系數(shù)與土壤鉛的生物可給性呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表4 遷移系數(shù)與土壤鉛的生物可給性之間的相關(guān)性Table 4 Correlations between mobility factor and bioaccessibility of soil Pb

2.2.3 影響因素的多元回歸

進一步對土壤鉛的生物可給性（因變量）的可能影響因素（自變量）進行逐步多元回歸分析，以此消除各因素間的多重共線性問題，結(jié)果見表5。可以看出，僅有土壤pH是土壤鉛在胃腸道的生物可給性的主導因子。

表5 土壤鉛的生物可給性的影響因素的多元回歸Table 5 Multivariate regression between bioaccessibility of soil Pb and the influencing factors

2.2.4 土壤間差異的機理分析

綜上所述，經(jīng)口部攝入的土壤鉛在人體胃腸道的生物可給性與土壤 pH、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)以及遷移系數(shù)有著密切關(guān)聯(lián)。在消除各因素間的多重共線性問題后，土壤pH被證實是土壤鉛在胃腸道的生物可給性的主導因子。以此為基礎(chǔ)，對鉛的生物可給性的土壤間差異進行機理分析推斷，并給予今后進一步的驗證性實驗研究以啟示。

土壤pH與土壤鉛的生物可給性呈高度顯著負相關(guān)，這與Yang et al.（2006）的研究結(jié)果一致，且土壤pH是土壤鉛的生物可給性的主導因子。較高的土壤pH有利于鉛與羥基形成復合物，可在一定程度上削弱鉛的溶解釋出；另外OH?可進一步削弱H+對交換位點競爭的能力，減少土壤中游離的鉛離子含量；還有學者認為，pH較高的土壤中粘土礦物、水合氧化物、有機質(zhì)等表面負電荷較多，可增強對鉛的吸附（Yang et al.，2006；鄭順安等，2013；Yang et al.，2015）。因此，pH值最低的紅壤中鉛的生物可給性較高；而pH值最高的黑土中鉛的生物可給性較低。

有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)雖不是直接影響土壤鉛的生物可給性的主導因子，但其與土壤鉛的生物可給性呈高度顯著負相關(guān)，這與Saminathan et al.（2010）的研究結(jié)果一致。有機質(zhì)表面具有大量的官能團，如羧基、氨基、羥基等都與鉛有著較高的親和力，而大分子固體腐殖質(zhì)可與鉛形成絡(luò)合物并具有較高的穩(wěn)定性（羅梅等，2020）。此外，帶負電荷的有機質(zhì)可吸附鉛離子（Udovic et al.，2012）。因此，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)最低的紅壤中鉛的生物可給性較高；而有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)最高的黑土中鉛的生物可給性較低。

遷移系數(shù)與土壤鉛的生物可給性呈高度顯著正相關(guān)。F1、F2、F3通常被認為是土壤中較活躍、易溶出的鉛的賦存形態(tài)，因此在模擬人體胃腸道消化過程的體外試驗中也更易于溶解釋出，進而被人體吸收。本研究中遷移系數(shù)最高的紅壤中鉛的生物可給性較高；而遷移系數(shù)最低的黑土中鉛的生物可給性較低。Tessier連續(xù)提取法的步驟相對繁瑣，所要消耗的時間（至少20 h）遠長于體外試驗（約6 h），因此體外試驗方法不僅直接而準確，且非常適用于大量土壤樣品的健康風險評估工作。

3 結(jié)論

（1）針對中國5種典型土壤（紅壤、褐土、黑土、棕壤、黃壤）的研究，為后續(xù)開展大范圍、高精度的實地鉛污染土壤健康風險評估工作提供了科學依據(jù)與參考。在相同鉛污染程度下（800 mg·kg?1），土壤鉛在胃階段的生物可給性為72.7%—82.6%，各類型土壤間差異極顯著，其中紅壤較高而黑土較低；進入小腸階段后，因環(huán)境條件的改變，尤其是消化液pH值的急劇升高，土壤鉛的生物可給性極顯著降低至22.8%—27.7%，各類型土壤間無顯著差異。經(jīng)口部攝入的土壤鉛對人體的健康風險評估結(jié)果與之相同。值得注意的是，對兒童而言，土壤鉛在胃階段的非致癌風險達到可接受限值的2.1倍；且整體而言，土壤鉛對兒童的非致癌風險平均達到成人的 7.6倍，應(yīng)給予重視。

（2）經(jīng)口部攝入的土壤鉛在胃腸道的生物可給性與土壤 pH、有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)和遷移系數(shù)分別呈高度顯著負相關(guān)、高度顯著負相關(guān)和高度顯著正相關(guān)；其中，土壤pH是土壤鉛在胃腸道的生物可給性的主導因子。通過體外試驗可直接、簡便而準確地獲取土壤鉛的生物可給性信息，建議在今后實地的污染土壤健康風險評估工作中引入該方法學。