新疆黃萎病發(fā)病程度不同棉田土壤細菌群落結構差異分析

劉海洋，張仁福，王偉，楊寒麗，姚舉*

1.新疆農業(yè)科學院植物保護研究所/農業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091；2.巴州農業(yè)技術推廣中心，新疆 巴音郭楞蒙古自治州 841000

新疆棉區(qū)棉花黃萎病發(fā)生日趨嚴重（劉海洋等，2018），但是目前針對該病的生態(tài)防控技術相對缺乏。土壤細菌中含有大量具有拮抗、促生作用的有益微生物，調控土壤微生物群落結構或改變微生物功能多樣性對土傳病害防控有積極作用（李斌等，2006；李勝華等，2009）。研究認為，土壤類型是形成土壤細菌功能群落的決定性因素（?nceoglu et al.，2012），而pH值、土壤水分是土壤細菌群落結構變化的主要驅動力（Bainard et al.，2016），此外，農業(yè)管理方式、種植作物種類、病原菌入侵（顧美英等，2009）等因素同樣會影響土壤細菌多樣性（Marschner et al.，2001；Suzuki et al.，2009；Tóth et al.，2017）。李雪萍等（2017）發(fā)現青稞根腐病的發(fā)生減少了作物根際土壤細菌和放線菌數量，而Yu et al.（2019）研究西瓜（Citrullus lanatus）根際細菌群落發(fā)現，接種尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）不僅增加了西瓜根際細菌群落的多樣性，同時激發(fā)了有益菌群的數量。Rosenzweig et al.（2012）亦發(fā)現在利于馬鈴薯（Solanumtuberosum）赤霉病發(fā)病的土壤中芽胞桿菌屬（Bacillus）的豐度顯著高于馬鈴薯赤霉病抑病土壤；Anees et al.（2010）同樣報道，立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）病區(qū)內木霉菌（Trichoderma）的豐度高于健康區(qū)域，且病區(qū)分離的木霉菌比健康區(qū)的木霉菌拮抗作用更強，但Luan et al.（2012）發(fā)現棉花黃萎病株根際土壤中木霉菌等有益菌群的數量顯著低于健康棉株，與Anees et al.（2010）研究結論相反。前人研究表明，土壤中有益細菌種群對土傳病害發(fā)生的響應存在爭議，且目前有關棉花黃萎病發(fā)生與土壤細菌群落尤其有益菌群相關性的研究較少，缺乏對棉田土壤有益細菌種群參與棉花黃萎病發(fā)生變化過程的了解。為此，本文采用Illumina Hiseq 2500測序平臺對新疆黃萎病發(fā)生程度不同棉田土壤細菌群落的結構特征進行分析，揭示新疆棉田土壤黃萎病變化過程中細菌群落多樣性變化、結構差異及主要影響因素，分析土壤細菌群落尤其有益菌群在棉花黃萎病發(fā)生過程中的作用，為提高新疆棉花黃萎病的生態(tài)防控技術水平提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

2016年在阿克蘇市（ 40°36′55.86″N，81°18′47.69″E ）、庫爾勒市（ 41°45′9.05″N，85°52′43.11″E）以及石河子市（44°19′8.17″N，85°59′26.44″E）分別選擇棉花黃萎病代表性的重病田與無（輕）病對照田各1塊，3地共計6塊棉田（劉海洋等，2019）。于8月在重病田采集發(fā)病等級3級以上棉株根圍土壤，對照田采集健康棉株根圍土壤，每塊棉田3點取樣，每取樣點間隔50 m，每點取0—20 cm土層5份土樣，每份200 g，混合為1份土壤樣品。共計18份混合樣品，經2 mm孔徑過樣篩處理，保存于?80 ℃冰箱備用，棉田土壤樣品類型及編號見表1。

表1 棉田土壤樣品類型及編號Table 1 Type and serial number of cotton field soil samples

1.2 采樣棉田信息

阿克蘇棉花黃萎病重病田（Aksu serious disease field，AD）為自然發(fā)病棉田；對照田（Aksu disease-free field，ACK）為相鄰的無病棉田，該棉田前期為棉花黃萎病重病田，經水稻輪作后變?yōu)闊o病田，種植棉花品種均為中棉49號。石河子棉花黃萎病重病田（Shihezi serious disease field，SD）、輕病對照田（Shihezi mildly disease field，SCK）均為自然棉田，種植棉花品種均為新陸早64號。庫爾勒棉田原為一整塊條田，從中間一分為二，一塊從2014年開始每年人工接種棉花黃萎病菌改造成重病田（Korla serious disease field，KD），另一塊未接種病原菌的作為對照田（Korla mildly disease field，KCK），種植品種均為新陸中66號。

以上棉田均為覆膜滴灌棉田，每個區(qū)域重病田與對照田的管理措施一致。棉田病情指數、土壤理化性質等數據見表2。

表2 采樣棉田土壤理化性質、病情指數和微菌核數量信息Table 2 Physical and chemical properties, disease index and microsclerotium amount of cotton soil in different regions

1.3 土壤DNA提取與文庫構建、測序

利用北京百泰克生物技術公司生產的 DP4001土壤試劑盒，嚴格按照操作步驟提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量，使用Nano Drop 2000 UV-Vis光譜儀測定DNA濃度，總量滿足 3次及以上建庫要求。所用引物為細菌16SrDNA（V3+V4）區(qū)域引物，338F：5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′。PCR 擴增程序：98 ℃預變性 2 min；98 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。由北京百邁客生物科技有限公司構建 DNA文庫，采用 Illumina Hiseq 2500 PE250模式進行測序。

1.4 數據處理與分析

對測序獲得的原始數據使用FLASH V1.2.7軟件（Mago? et al.，2011），按照最小重疊長度 10 bp、重疊區(qū)最大錯配比率0.2對每個樣品的序列進行拼接，得到的拼接序列即原始序列。將拼接得到的序列用Trimmomatic軟件設置50 bp的窗口，過濾質控后長度小于標簽長度75%的標簽，使用UCHIME軟件（Edgar et al.，2011）并去除嵌合體，得到高質量的序列。在相似性97%的水平上使用UCLUST軟件（Edgar，2010）對序列進行聚類，以所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU。在細菌16S Silva數據庫（Quast et al.，2012）進行比對，在置信度閾值為0.8利用RDP Classifier軟件（Wang et al.，2007）進行物種注釋分類。利用 PyNAST軟件（Caporaso et al.，2010）進行多重比對，鄰接法建樹。利用Mothur version V.1.30軟件（Schloss et al.，2009）進行Alpha多樣性指數分析，包括ACE指數、Chao1指數、香農-威納指數；基于Bray curtis算法呈現物種多樣性矩陣，進行 Beta多樣性分析（n≥3），繪制樣本非度量多維尺度分析以及環(huán)境因子與樣本組成冗余分析。利用LEfSe分析方法設定顯著差異的LDA值為4.0，尋找組間豐度差異顯著物種。

利用Excel軟件對數據進行整理、匯總及相關系數等計算分析，利用SPSS 19.0軟件中的Duncan分析法對數據進行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 棉田土壤細菌的Alpha多樣性分析

在97%相似度水平下，阿克蘇、石河子兩地重病田土壤細菌的OTU數量及ACE指數、Chao1指數、Shannon-Wiener指數均高于各自無（輕）病對照田土壤，但是各項指數均未達顯著性差異（P＜0.05）。石河子重病田土壤細菌的 OTU 數量低于對照田土壤，無顯著差異，ACE指數、Chao1指數均顯著低于對照田土壤，而Shannon-Wiener指數顯著高于對照田土壤。綜合來看，三地重病田土壤細菌的Shannon-Wiener指數均高于對照田土壤，黃萎病的發(fā)生在一定程度上增加了土壤的細菌多樣性（見表3）。

表3 采集土壤中細菌Alpha多樣性指數Table 3 Alpha diversity index of bacterial community in soil samples

2.2 棉田土壤細菌群落的聚類分析

聚類分析發(fā)現，阿克蘇重病田樣品 an8b1、an8b2、an8b3單獨聚為一支，對照田土壤樣品a8w1、a8w2、a8w3單獨聚為一支，土壤細菌群落結構差異明顯（圖1a）；石河子重病田樣品sn8b1、sn8b2、sn8b3單獨聚為一支，對照田樣品bn8w1、bn8w2、bn8w3同樣聚為一支，土壤中細菌群落組成差異明顯（圖1b）。而庫爾勒土壤樣品聚類分析結果與阿克蘇、石河子均不同，來自輕病對照田的k8c1單獨聚為一支，來自重病田的k8v1、k8v2、k8v3與來自對照田的k8c2、k8c3聚在一支，且來自重病田的k8v2與來自對照田的k8c2聚為一支，庫爾勒重病田和對照田土壤細菌群落具有較高的相似性（圖1c）。

圖1 土壤樣品中細菌群落聚類分析Fig.1 Cluster analysis of bacterial community in different soil samples

2.3 土壤中細菌屬分類水平有益種群分析

阿克蘇、石河子、庫爾勒三地棉田土壤中細菌屬分類水平豐度前 20的種群中能分類到屬的有Sphingomonas、溶桿菌屬（Lysobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和Haliangium（0.81%—2.0%）（見圖 2），其中溶桿菌屬、假單胞菌屬包含多種對病原真菌具有拮抗作用的菌群，分析發(fā)現溶桿菌屬在阿克蘇AD組土壤中的豐度值為3.67%，顯著高于ACK組（2.35%）；在庫爾勒KD組（1.05%）和對照 KCK組（1.37%）之間以及在石河子 SD組（1.15%）和SCK組（0.97%）之間均沒有顯著差異。假單胞菌屬在阿克蘇 AD組土壤中的豐度值為3.15%，極顯著高于 ACK組（0.18%）；在庫爾勒KD組（1.73%）和對照KCK組（1.67%）之間沒有顯著差異，在石河子 SD組（0.18%）、SCK組（0.29%）之間同樣沒有顯著差異。芽胞桿菌屬包含大量的有益拮抗菌，分析發(fā)現其在新疆棉田土壤中并不是優(yōu)勢菌群，豐度比例較低，該屬在 AD組（0.13%）和ACK組（0.23%）、KD組（0.11%）和KCK組（0.09%）、SD組（0.10%）和SCK組（0.11%）之間均無顯著性差異。鏈霉菌屬（Streptomyces）同樣在AD組（0.23%）和ACK組（0.26%）、KD組（0.21%）和KCK組（0.37%）、SD組（0.26%）和SCK組（0.30%）之間均無顯著性差異。

圖2 棉田土壤屬水平細菌種群組成分析Fig.2 Bacterial communities in rhizosphere soil of cotton on genus level

綜合來看，溶桿菌屬和假單胞菌屬在阿克蘇重病田土壤中的豐度均顯著高于無病田對照，而芽胞桿菌屬和鏈霉菌屬的豐度在阿克蘇、石河子和庫爾勒三地重病田與對照田之間均無顯著差異。

2.4 棉田土壤細菌群落的組間差異分析

LEfSe分析發(fā)現，當LDA值≥4.0時，阿克蘇AD組中的顯著差異種群為變形菌門（Proteobacteria）、γ變形菌綱（Gammaproteobacteria）、黃單胞桿菌目（Xanthomonadales）以及假單胞菌目（Pseudomonadales）、假單胞菌科（Pseudomonadae）、假單胞菌屬，ACK組土壤中顯著差異種群為酸桿菌門（Acidobacteria），顯著差異物種主要集中在AD組土壤中（圖3a）。石河子SD組土壤中的顯著差異種群為放線菌門（Actinobacteria）；SCK組中的顯著差異種群為酸桿菌門（Acidobacteria）、Blastocatellia、Blastocatellales、Blastocatellae_Subgroup_4，顯著差異種群主要集中在SCK組中（圖3b）。而庫爾勒人工接種KD組與KCK組之間的細菌種群在門至屬分類水平上都沒有顯著差異種群（圖3c）。

圖3 不同土壤細菌種群組間差異分析Fig.3 Analysis of the difference between bacterial populations in different soil samples

2.5 土壤理化性質與細菌多樣性的相關性

由表4可知，土壤pH值與土壤細菌的OTU數量和ACE指數、Chao1指數、Shannon指數均呈顯著正相關，表明在一定區(qū)間內，土壤pH值升高對土壤細菌的豐度和多樣性有促進作用；土壤總鹽含量與土壤細菌OTU數量和ACE指數、Chao1指數、Shannon指數均呈顯著負相關，土壤總鹽含量升高，對土壤細菌的豐度和多樣性有抑制作用。全鉀含量與土壤細菌OTU數量以及ACE指數、Chao1指數正相關，土壤碳氮比與土壤細菌的OTU數量、ACE指數、Chao1指數、Shannon指數均負相關。土壤有機質、全氮、全磷含量均與土壤細菌的 OTU數量和Alpah指數無顯著相關。

表4 土壤理化性質與細菌多樣性指數的相關系數Table 4 Correlation analysis of soil physical and chemical properties with bacterial diversity index

2.6 土壤理化性質、發(fā)病程度與細菌種群的冗余分析

2.6.1 土壤理化性質與細菌種群的冗余分析

根據圖4可知，土壤理化性質與豐度前20的細菌種群的相關程度較高，其中節(jié)桿菌屬、黃單胞菌屬、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Sphingopyxis、Defluviicoccus、Ilumatobacter、Pelagibius與土壤全鹽（TS）呈顯著正相關。Bryobcter、Sphingomonas、Nitrospira與土壤 pH 值顯著正相關。Altererythrobacter、Lysobacter、Thermomonas與土壤全鉀（TK）顯著正相關，Sterioidobacter與 TK負相關。Blastocatella、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Haliangium 與土壤中全氮（TN）、有機質（OM）含量呈顯著正相關，假單胞菌屬、Arenimonas、Iamia與土壤中全氮、有機質含量呈顯著負相關。

圖4 土壤細菌群落與土壤理化性質的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of soil bacterial community with soil physical and chemical properties

2.6.2 發(fā)病程度與細菌種群的冗余分析

由圖5中看出，土壤豐度前20的細菌屬中僅熱單胞菌屬（Thermomonas）、Steroidobacter與棉田發(fā)病程度（DI，病情指數）顯著正相關，而其余18個細菌屬與棉田黃萎病的發(fā)生程度無明顯相關性。

圖5 病情指數與土壤理化性質的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of soil bacterial community with the disease index

3 討論

3.1 田間病情對土壤細菌群落多樣性和種群結構無顯著影響

抑病性土壤能夠提供豐富的微生物資源，被應用于植物土傳病害的生物防治中，但在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中還未充分認識到這一現象的功能并加以應用（Mazzola，2004），本研究旨在探究新疆不同發(fā)病程度棉田土壤是否存在有益菌群的差異，并了解棉花黃萎病發(fā)生對棉田土壤細菌群落的影響。前人報道，西瓜接種尖孢鐮刀菌增加了其根際細菌群落多樣性的同時激發(fā)了有益菌群（Yu et al.，2019），馬鈴薯赤霉病土壤中含有大量拮抗菌的芽胞桿菌屬，其豐度顯著高于抑病土壤（Rosenzweig et al.，2012），立枯絲核菌病區(qū)內的木霉菌豐度和拮抗作用均高于健康區(qū)域（Anees et al.，2010），以上研究均表明土壤中病原菌與有益菌群具有某種互作關系。本研究發(fā)現，阿克蘇、石河子、庫爾勒三地重病田土壤中細菌的Shannon指數均高于對照田，其中石河子重病田 Shannon指數顯著高于其輕病對照田，與Yu et al.（2019）研究認為病原菌侵染增加了土壤細菌多樣性的結論較為一致。但本文未發(fā)現在庫爾勒人工接種重病棉田和對照田土壤中的有益細菌種群如溶桿菌屬（Jochum et al.，2006；Ji et al.，2008；Ko et al.，2009）、假單胞菌屬（Kloepper et al.，1980）、鏈霉菌屬（Sabaratnam et al.，2002）、芽胞桿菌屬存在顯著差異，這與Rosenzweig et al.（2012）和 Anees et al.（2010）認為病原菌的存在激發(fā)了土壤中芽胞桿菌屬、木霉菌等有益菌豐度的研究結果不同，而Lioussanei et al.（2010）報道番茄接種煙草疫霉菌（Phytophthoranicotianae）未對番茄根際細菌群落結構產生顯著影響，本研究與該研究結論有較好的一致性。與此同時，本研究發(fā)現庫爾勒人工接種重病田與其對照田土壤之間細菌群落相似度很高，無顯著差異的種群，說明土壤細菌群落結構受病原菌的影響較小。

3.2 土壤理化性質對細菌群落多樣性和種群結構影響顯著

土壤pH值、含水量、電導率以及堿解氮、有效磷等養(yǎng)分含量等多種因素與土壤細菌群落結構的變化有關（Preem et al.，2012；Yang et al.，2017）。然而，Shen et al.（2016）研究發(fā)現在集約化管理的生態(tài)系統(tǒng)中高施氮量會導致土壤次生鹽堿化和酸化，從而降低土壤細菌系統(tǒng)類型豐富度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性，細菌群落與土壤pH值呈正相關，與土壤電導率呈負相關。Bainard et al.（2016）、Meng et al.（2019）也一致認為pH是影響土壤細菌群落結構和多樣性的主要因素。Zheng et al.（2019）研究番茄田間細菌群落多樣性與青枯?。≧alstonia solanarum）嚴重程度的關系發(fā)現，健康土中變形菌門的豐度較高，酸桿菌門的豐度較病土低。青枯雷爾氏菌豐度與全氮、土壤 pH、有機碳、總磷、總鉀呈顯著相關，與綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）和浮霉菌門（Planctomycetes）的豐度呈正相關，與硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）的豐度呈負相關。本研究發(fā)現，土壤理化性質是造成阿克蘇、石河子兩地重病棉田與其對照棉田土壤中細菌群落結構顯著差異的原因，土壤pH值、總鹽含量是影響細菌群落多樣性及其種群結構的主要因素，其中pH值與細菌群落多樣性呈顯著正相關，總鹽與細菌群落多樣性呈顯著負相關，結論與前人研究一致，而全氮、全磷、有機質與細菌群落多樣性相關不明顯，Marschner et al.（2001）亦發(fā)現氮肥對土壤細菌群落結構沒有顯著影響，本文研究結論與前人一致。

3.3 其他因素對土壤細菌群落多樣性的影響

土地利用歷史、作物品種、輪作等管理措施對土壤細菌群落影響顯著。Bainard et al.（2016）發(fā)現細菌群落在作物整個生長季出現時間變化，細菌群落變化與土壤水分及濕度、溫度等因素息息相關，Kang et al.（2004）報道土壤細菌群落結構有強烈的時間趨勢，空間分異明顯，也認為細菌群落差異與土壤含水量有顯著的相關性。作物輪作是控制土傳病害的傳統(tǒng)方法，但是Navarro-Noya et al.（2013）發(fā)現小麥（Triticumaestivum）-玉米輪作對土壤細菌群落結構影響不顯著，Bainard et al.（2016）也報道土壤細菌群落的變化不受作物（小麥、小扁豆Polygalatatarinowii、豌豆Pisum sativum、歐洲油菜Brassicanapus）種類的影響，而是土壤環(huán)境因子削弱或平衡了作物對土壤細菌群落的影響。Suzuki et al.（2009）亦認為土壤類型對細菌群落的影響大于施肥。?nceoglu et al.（2012）同樣發(fā)現土壤類型是形成馬鈴薯根際細菌功能群落的最具決定性參數，但其肯定了作物品種對微生物群落結構有顯著影響，不同作物品種對微生物群落的利用存在差異。

綜合前人研究來看，土壤理化性質、土壤類型、土壤水分等是影響土壤細菌群落的主要因素，植物種類、作物輪作等因素對土壤微生物群落結構的影響存在一些爭議。土傳病害的減輕與土壤中病原菌減少、病原菌致病力下降或有益微生物種群的增多有關，本文觀察到棉花黃萎病重病田在2015年種植水稻后棉花黃萎病菌消失變?yōu)闊o病田（ACK），但在病情變化過程中未觀察到ACK組中芽胞桿菌屬、假單胞菌屬等有益菌群顯著高于AD組的證據，反而AD組中溶桿菌屬和假單胞菌屬豐度均顯著高于ACK組，與Rosenzweig et al.（2012）和Anees et al.（2010）的研究結果相近。Larkin et al.（2011）田間首季種植白芥菜（Sinapis alba）+東方芥菜（Brassicajuncea）、高粱（Sorghum bicolor）-蘇丹草（Sorghumsudanense）雜交種兩種綠肥后顯著減輕了后茬的馬鈴薯黃萎病，然而第二季種植再兩種綠肥后黃萎病依然發(fā)生嚴重，前期種植歷史對病害或土壤微生物群落的顯著影響減弱了，加之 Bainard et al.（2016）、Navarro-Noya et al.（2013）均認為作物對土壤微生物沒有顯著影響，而土壤水分的變化會顯著影響土壤微生物群落結構（Kang et al.，2004；Bainard et al.，2016）。本文綜合分析認為可能是由于土壤水分等非生物操作因素減輕了棉花黃萎病的發(fā)生（ACK），而不是由于土壤中有益種群的變化造成的。

4 結論

（1）阿克蘇、石河子、庫爾勒三地重病棉田土壤中細菌的Shannon-Wiener指數均高于對照田，其中石河子重病田土壤細菌的Shannon指數顯著高于對照田，黃萎病的發(fā)生增加了棉田土壤的細菌多樣性，但土壤細菌的OTU數量、ACE指數和Chao1指數在不同區(qū)域的棉花黃萎病發(fā)病程度不同棉田之間沒有一致規(guī)律。阿克蘇、石河子兩地重病棉田均分別與其對照棉田土壤中細菌群落差異明顯，而庫爾勒人工接種重病棉田與對照田土壤中細菌群落相似性較高，無顯著差異種群。病原菌入侵對土壤細菌群落結構的影響較小。

（2）土壤細菌多樣性、種群結構受土壤理化性質影響顯著，其中土壤pH值、總鹽是主要影響因子，棉田土壤細菌的OTU數量、Alpah多樣性指數與土壤pH值、全鉀含量呈顯著正相關，與總鹽含量、碳氮比呈顯著負相關，與有機質、全氮、全磷含量及棉田發(fā)病程度無明顯相關。

（3）棉田土壤中有益菌群在庫爾勒人工接種重病棉田土壤中的豐度與對照田無顯著差異，溶桿菌屬和假單胞菌屬在阿克蘇重病棉田土壤中的豐度顯著高于無病對照田，石河子重病田土壤中顯著富集了放線菌門，未發(fā)現有益細菌種群參與黃萎病減輕或加重過程的證據，非生物因素可能是減輕棉花黃萎病發(fā)生的主要原因。