STAT3及其多態性在HPV16所致宮頸癌發生過程中的作用研究

莫小亮 覃桂榮 蔣曉莉 周卓琳 袁 媛

廣西醫科大學第一附屬醫院計劃生育病區，廣西南寧 530021

女性生殖系統常見一類惡性腫瘤為宮頸癌，疾病發病率僅次于乳腺癌，位居女性惡性腫瘤第二位。近些年來，宮頸癌疾病呈現上升及年輕化趨勢，成為威脅中青年女性健康的惡性疾病。早期階段宮頸癌癥狀隱匿，缺乏特異性，多數患者確診就醫發展至中晚期，錯過最佳治療時間，患者預后較差[1]。目前對宮頸癌發病機制尚不明確，臨床缺乏敏感、特異的早期診斷方法及有效治療手段[2]。因此，探索宮頸癌發病相關分子機制，尋找腫瘤診斷新型分子標志物及治療靶標具有重要臨床意義。相關研究表明[3]，人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染作為宮頸癌發生重要致病因素，與多個方面因素影響，需全面對致病機制深入探討。轉錄活化子（signal transducer and activator of transcription，STAT）參與細胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等過程，且與腫瘤產生聯系緊密[4]。本研究旨在探討STAT3 基因表達及其多態性在HPV16 所致宮頸癌發生過程中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2015年1月～2017年12月廣西醫科大學第一附屬醫院收治的40 例慢性宮頸炎患者、27 例宮頸上皮內瘤變患者及17 例宮頸癌患者作為研究對象。納入標準：①患者均經臨床確診；②患者及家屬知曉本研究開展經過，并自愿參與；③臨床依從性偏高，配合后續研究開展。排除標準：①中途轉院及失訪者；②存在影響研究開展的其他疾病。慢性宮頸炎患者中，年齡27～64 歲，平均（45.6±4.5）歲；病程1～23 個月，平均（6.9±1.5）個月。宮頸上皮內瘤病變患者中，年齡29～66 歲，平均（46.2±5.1）歲；病程1～24 個月，平均（7.5±1.4）個月。宮頸癌患者中，年齡29～64 歲，平均（45.9±4.2）歲；病程1～24 個月，平均（7.6±1.3）個月。三組患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。另外收集10 名健康體檢者的樣本資料，在PCR-反向點雜交法下展開HPV16 E6 蛋白基因測定，為陰性表達對照。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

HPV16 E6 蛋白測定：標本制作成石蠟組織，切片后進行HE 染色，開展分型檢測HPV 亞型，采取聚合酶鏈反應（PCR）-反向點雜交法。并采取免疫組化Supervision TM 二步法，檢測標本中HPV16 E6 蛋白表達水平，檢測方法為切片染色，要求病理科醫師進行雙盲閱片，HPV16 E6 蛋白表達陽性細胞染色表現為棕黃色顆粒，表達位置為細胞核，鏡下染色后，陽性細胞及染色強度結果開展半定量評分。依據細胞著色深淺分為無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色，分別為0、1、2、3 分，0～1 分為陰性，2 分以上為陽性。

STAT3 基因測定：制備病理組織標本，并取各組病例組織5 cm×5 cm，利用10%甲醛固定，石蠟包埋，將其切片為厚度為3 μm 切片，采取HE 染色，采用聚合酶鏈反應（PCR）測定STAT3 基因型，構建STAT3引物（上游引物：5′-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3′，下游引物：5′-GTTGGGCTCAAATACGGTGG-3′），以β球蛋白基因（350 bp）作為參照基因，取上下游引物各2 μL、DNA 聚合物25 U、氯化鉀50 mmol/L、氯化鎂1.5 mmol/L 及相應緩沖液。反應條件：94℃預變性5 min，變形30 s，63℃下退火30 s，72℃延伸30 s，經35 個循環后72℃延伸5 min，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 擴增產物基因型。采取PCR-制片段長度多態性（RFLP）對各組STAT3 基因C1697G 多態性測定。

1.3 觀察指標

采用免疫組化檢測HPV16 E6 在健康體檢者、慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中的表達。對E6、STAT3 蛋白在慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌中的表達情況進行統計，比較STAT3 基因多態性在慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌基因中表達情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者E6、STAT3 蛋白表達情況的比較

宮頸癌患者的E6 蛋白陽性表達率（76.47%）高于慢性宮頸炎（2.50%）、宮頸上皮內瘤變（48.14%），STAT3 蛋白陽性表達率（82.35%）高于宮頸上皮內瘤變（44.44%）、慢性宮頸炎（5.00%），差異有統計學意義（P＜0.05）；宮頸上皮內瘤變患者的E6 及STAT3 蛋白陽性表達率均高于慢性宮頸炎，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者E6、STAT3 蛋白表達情況的比較[n（%）]

2.2 慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者STAT3基因多態性表達情況的比較

G/G 型占比中，宮頸癌（5.88%）、宮頸上皮內瘤變（59.26%）低于慢性宮頸炎（92.50%），宮頸癌低于宮頸上皮內瘤變，差異有統計學意義（P＜0.05）；C/C 型占比中，宮頸癌（82.35%）、宮頸上皮內瘤變（25.93%）高于慢性宮頸炎（2.50%），宮頸癌高于宮頸上皮內瘤變，差異有統計學意義（P＜0.05）；慢性宮頸炎（5.00%）、宮頸上皮內瘤變（14.81%）、宮頸癌（11.76%）的G/C 型占比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變及宮頸癌患者STAT3 基因多態性表達情況的比較[n（%）]

2.3 典型案例分析

健康體檢者PCR-反向點雜交法下HPV16 E6 蛋白基因測定陰性表達對照見圖1；慢性宮頸炎患者，45 歲，PCR-反向點雜交法下HPV16 E6 蛋白基因在慢性宮頸炎患者中的表達見圖2；宮頸上皮內瘤變患者，44 歲，PCR-反向點雜交法下HPV16 E6 蛋白基因在宮頸上皮內瘤變患者中的表達見圖3；宮頸癌患者，42 歲，PCR-反向點雜交法下HPV16 E6 蛋白基因在宮頸癌中的表達見圖4。

3 討論

婦科常見一類惡性腫瘤為宮頸癌，數據顯示每年新發患病人數達到50 萬，占所有婦科癌癥的10.00%，總計發病率為所有腫瘤的5.00%，僅次于乳腺癌，在發病地區統計結果上，85.00%以發展中國家為主，占據所有病例的80.00%[5]。據統計，全球宮頸癌發病死亡人數統計數據為27 萬例，發展中國家占4/5。對國內宮頸癌發病病例統計顯示，我國占據全世界總發病人數1/3，且每年以2%～3%速度增長，疾病發病率呈現年輕化趨勢[6]。

圖1 HPV16 E6 表達陰性對照（免疫組化，100×）

圖2 HPV16 E6 在慢性宮頸炎中的表達（免疫組化，100×）

圖3 HPV16 E6 在宮頸上皮內瘤變中的表達（免疫組化，100×）

圖4 HPV16 E6 在宮頸癌中的表達（免疫組化，100×）

相關研究證實[7]，絕大多數宮頸上皮不典型增生、宮頸癌患者中，經檢測存在HPV 感染。99.7%宮頸癌標本中可檢測出HPV-DNA。HPV 感染與宮頸上皮內瘤變及宮頸癌惡性病變有顯著聯系。因此，HPV 感染可作為宮頸癌病變重要前提。隨著HPV 感染人群數量增多，宮頸癌發病人群數量相對提升，但HPV 感染嚴重病變程度作為宮頸癌發病重要前提，其他外界因素同樣占據重要地位，如飲食、衛生習慣等，表明疾病形成是多種致癌因素長期共同作用的結果[8]。STAT 作為介導細胞信號轉導的轉錄因子，是JAK-STAT 信號轉導途徑重要環節，轉導始于細胞表面受體，當成分與特異性DNA 啟動子序列結合，信號轉至細胞核，并調控基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡及血管形成過程，在腫瘤發生中起著重要作用[9-10]。STAT3 位于11 號染色體，并被多種細胞因子激活，功能復雜。正常生理狀態下，STAT3 信號轉導途徑在多種生理過程中發揮重要作用，如胚胎發育、器官形成、先天及后天免疫調節。同樣，當機體感染多種致癌蛋白后，STAT3 被激活，如V-Src、V-Fps、V-Erk 等，上調凋亡抑制基因Bcl-XL、Mcl-1 及細胞周期調節基因cyclinDl抑制細胞凋亡，激活血管內皮生長因子啟動子，可誘導腫瘤血管生成。STAT3 組成性活化能阻斷凋亡細胞惡化轉化，能促進腫瘤細胞增殖、血管形成，阻斷STAT3表達對腫瘤的治療具有巨大的潛在價值。

本研究檢測了HPV16 E6 及STAT3 蛋白、STAT3基因多態性的表達情況，結果顯示，宮頸癌患者的STAT3 蛋白陽性表達率（82.35%）高于宮頸上皮內瘤變（44.44%）、慢性宮頸炎（5.00%），差異有統計學意義（P＜0.05）。有研究證實[11]，STAT3 的組成性活化能促進細胞的惡性轉化并阻斷調亡，促進腫瘤細胞的增殖，血管形成，在人類子宮內膜癌及宮頸癌中處于活性狀態，當抑制STAT3 組成型激活可能是干預這兩類婦科疾病有效靶點。鑒于STAT3 的致癌作用，本研究將其與宮頸癌密切相關的HPV16 E6 蛋白相結合，分析二者在不同程度宮頸病變組織中的表達。有研究發現[12]，STAT3 在宮頸癌表達水平與癌前病變水平呈現顯著差異，隨著宮頸病變程度加重，STAT3 表達陽性率相應升高，與本研究得出的論點一致。同時還有研究發現[13]，HPV16 E6 蛋白及STAT3 在宮頸癌中表達具有一定相關性。因此，惡性腫瘤轉化中，HPV16 與STAT3 之間存在某種相互關系。甚至有相關研究[14]指出，惡性組織切片中，HPV DNA 整合增加編碼E6、E7 癌蛋白的mRNA 的穩定性，導致E6、E7癌蛋白表達增強，對細胞與信號轉導因子造成影響。STAT3 作為細胞信號轉導的轉錄因子，與HPV E6 與之間必然存在著某種關系，但其與STAT3 在宿主宮頸細胞惡性轉化過程中的相互作用機制仍需深入探究。基因多態性是目前研究熱點，當一個基因多態性發生改變時可引起其他基因型發生相應改變，進而引發相關疾病，基因多態性可作為疾病診斷依據及預后判斷重要指標。STAT3 基因多態性分包括G/G 型、G/C 型、C/C 型，本研究進一步對STAT3 基因多態性進行分析比較，結果顯示，宮頸癌、宮頸上皮內瘤變的G/G 型占比（5.88%、59.26%）低于慢性宮頸炎（92.50%），差異有統計學意義（P＜0.05）；而慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤變和宮頸癌的C/C 型占比分別為2.50%、25.93%、82.35%，比較差異有統計學意義（P＜0.05），因此，HPV 感染風險上升，宮頸癌發生風險上升，C/C 基因占比伴隨疾病程度增加，則整體患宮頸癌機率增高。Zhou 等[15]研究指出，隨著宮頸病變程度加重，患者STAT3 基因C/C 型顯著增高，G/G 型占比降低，提示宮頸癌發生與STAT3 聯系緊密，C/C 基因型與HPV 感染風險上呈現正比關系。STAT3 基因突變可增加HPV 感染風險以及宮頸癌患病風險，其發病機制往往與HPV 感染后激活STAT3 信號通路，介導E6、E7 致癌蛋白通路相關，致癌蛋白經多種途徑，促進細胞增殖、惡化及血管形成宮頸癌[16]。宮頸癌產生為多種因素共同影響結果，此時STAT3 基因突變，增加HPV16 感染風險及宮頸癌風險，提示STAT3 在宮頸癌發生、病情發展中起著重要作用，可作為臨床診斷重要指標。

綜上所述，STAT3 與HPV16 所致宮頸癌發生聯系緊密，提示STAT3 和HPV16 在宮頸病變發生和發展過程中發揮重要作用。