低氧誘導因子對SD大鼠髓核細胞凋亡路徑中相關蛋白表達的影響

李 旭 葉 放 劉一秀 趙 宇 謝 鑫 楊立群 屠冠軍

1.沈陽醫學院附屬中心醫院足踝外科，遼寧沈陽 110024；2.遼寧中醫藥大學機能實驗中心，遼寧沈陽 110847；3.中國醫科大學遼寧省計劃生育研究所，遼寧沈陽 110031；4.中國醫科大學第一臨床醫院骨科，遼寧沈陽 110001

低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是誘導低氧基因和維持細胞氧內環境穩定的核心因子，可以調節能量代謝，血管形成，細胞凋亡，細胞分化，基質合成等相關基因的表達[1]。間盤組織處于一種低氧環境中，研究表明HIF－1α 在間盤中有表達[2]。Ha[3]等研究發現，在不同程度人突出椎間盤中，HIF-1α 的表達程度與細胞凋亡程度之間存在高度相關性，而其作用于髓核細胞凋亡的路徑尚不完全清楚。本研究探討HIF-1α 在間盤細胞凋亡中的作用，通過檢測HIF-1α 誘導凋亡途徑中凋亡相關蛋白的表達情況，揭示HIF-1α 在SD 大鼠髓核細胞線粒體凋亡路徑中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

選擇剛斷奶的30日齡SD 大鼠，一共20 只，清潔級，由中國醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（遼）2013-0001，檢疫合格備用，經過相關動物倫理委員會審核同意，選擇光線充足、通風良好的實驗環境，適應性喂養1 周后備用，其中10 只為雌性，10 只為雄性，體重為50～60 g。

SABC 免疫組化試劑盒（博士德公司，批號：QD82102），兔抗鼠Ⅱ型膠原一抗（Neomakers 公司，批號：SC17852），山羊抗兔抗體（IgG）（北京百奧萊博科技有限公司，批號：F030212），單克隆兔抗鼠HIF-1α一抗（Santa Cruz 公司），CAY10585（cayman 公司，批號：10012682-5），CoCl2（上海邁瑞爾化學技術有限公司，批號：20080890），CO2培養箱（德國Seracell），三氣低氧培養箱（型號：Heraeus cell 150），倒置相差顯微鏡（奧特光學器材廠），正置光學顯微照相系統（奧特光學器材廠，型號：Olympus BX51），電泳儀（美國IKA 公司），轉印儀（美國IKA 公司），722 分光光度計（美國IKA 公司），流式細胞儀（Calibar BD USA）。

1.2 髓核細胞原代培養及純化

在無菌條件下取30日齡SD 大鼠腰椎髓核組織，用小剪刀將其剪碎成約1 mm3的碎塊。以0.25%的胰蛋白酶液于室溫下消化20 min。低速離心（1000 r/min）10 min，吸取上清液，以2%的Ⅱ型膠原酶于孵箱中消化過夜。髓核細胞經無菌尼龍濾網過濾（孔徑75 μm），計數。將細胞接種于12 孔板中，按1×104/mL 密度接種。在37℃、5% CO2的培養箱中培養，培養基為DMEM/F12 加20%的胎牛血清，每3 天換液1 次，按時用倒置顯微鏡觀察、拍照。細胞融合為單層時用胰蛋白酶消化并進行細胞傳代。

將培養所得細胞懸液置于無血清培養瓶中靜置4 h，實時在相差顯微鏡下對培養的細胞進行觀察，當發現細胞貼壁搖晃培養瓶貼壁細胞不浮起時，將上液倒入另一培養瓶繼續培養，反復操作，以便將髓核細胞分離開來。

1.3 使用SABC 法對Ⅱ型膠原進行檢測

細胞爬片后以10%福爾馬林固定，30% H2O2一份加純甲醇50 份混合以滅活內源性過氧化物酶，滴加5% BSA 封閉液阻斷，室溫20 min 后加稀釋的兔抗鼠Ⅱ型膠原一抗，37℃1 h，滴加山羊抗兔IgG 抗體，37℃20 min，滴加試劑SABC，DAB 顯色后脫水、透明、封片后觀察。

1.4 實驗分組及施加處理因素

將培養所得的髓核細胞分為四組進行處理，具體如下。A 組（低氧條件組）：O25%，CO25%，N290%（模擬正常間盤環境）；B 組（過度低氧條件組）：O22%，CO25%，N293%（模擬退變間盤環境）；C 組（低氧并經Co-Cl2處理組）：O25%，CO25%，N290%（HIF-1α 高表達）；D 組（低氧條件并經CAY10585 處理組）：O25%，CO25%，N290%（HIF-1α 表達受抑制）。通過促進（C組）與抑制（D 組）HIF-1α 表達，并與對照組（A 組）進行比較，驗證HIF-1α 表達多少與p53、Bax、caspase3、Bcl-2 表達趨勢間的關系及與髓核細胞凋亡之間的關系。各組在各自條件下培養24 h。CoCl2濃度為200 mmol/L，CAY10585 濃度為0.01 mmmol/L。

1.5 Western Blot 檢測各蛋白表達

收集各組細胞，提取蛋白，蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉印，封閉過夜，堿性磷酸酶顯色。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

消化，洗滌，調整細胞濃度到1×106/mL 后離心，固定，PI 染色，上機檢測，輸入計算機分析細胞凋亡的百分率。

1.7 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計學軟件進行相關分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較先行ANOVA 檢測，兩組間比較采用t 檢驗；相關性分析采用Pearson 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 使用倒置相差顯微鏡對細胞形態進行觀察

髓核細胞在顯微鏡下為梭形或多角形，輪廓比較清楚，細胞核為圓形（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下查看培養細胞的形態（100×）

2.2 免疫組化法Ⅱ型膠原染色

髓核細胞漿中表達的Ⅱ型膠原在顯微鏡下染色呈現為棕色染色，細胞核核圓形呈藍色染色（圖2）。

圖2 顯微鏡下觀察染色的髓核細胞鏡下形態（SABC，400×）

2.3 Western Blot 檢測各相關蛋白表達的情況及流式細胞術檢測各組髓核細胞凋亡的情況

Western Blot 呈現的結果顯示，HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2、caspase3 在各組中均有表達（圖3）。單因素方差分析結果顯示，各組的相關蛋白表達情況及髓核細胞凋亡情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。C 組中HIF-1α 蛋白的表達高于A 組和B 組，B 組中HIF-1α 蛋白的表達高于A 組，D 組中HIF-1α 蛋白的表達低于A 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。p53、Bax、caspase3 蛋白表達的趨勢在各組中相一致，在C組中最高，且表達程度高于A 組和B 組，B 組高于A 組，D 組表達最低，而且亦低于A 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。Bcl-2 蛋白的表達情況上，C 組中最低，低于A 組，D 組最高，高于A 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，單因素方差分析結果顯示，各組的凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中C 組高于B 組和A 組，B 組高于A 組，D 組低于A 組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖3 Western Blot 檢測各相關蛋白表達的情況

2.4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡的情況

細胞凋亡率上，C 組＞B 組＞A 組＞D 組（圖4）。

2.5 HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率的相關性分析

HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率均呈正相關性（P＜0.05）（表2）。

3 討論

目前臨床上多種脊柱退變性疾病都是由椎間盤的退變[4]引起的，嚴重影響著患者的工作及生活質量，而在對此類疾病的治療方面不論是通過非手術治療還是通過手術治療都不能得到令人滿意的效果。因此，很多學者越來越熱衷于探索椎間盤退變的分子生物學機制研究，以期在出現癥狀之前可以早期干預椎間盤組織的退變并逆轉此過程[5]，以達到早期治療脊柱退行性疾病的目的。椎間盤組織中的髓核細胞是主要功能細胞，研究表明髓核細胞凋亡在間盤組織退變過程中起到了至關重要的作用[6-7]。

表1 四組相關蛋白表達情況及髓核細胞凋亡情況的比較（±s）

表1 四組相關蛋白表達情況及髓核細胞凋亡情況的比較（±s）

B 組與A 組比較，*P＜0.05

組別HIF-1αp53BaxBcl-2caspase3凋亡率（%）A 組B 組C 組D 組F 值P 值tC 組與A 組比較值PC 組與A 組比較值tC 組與B 組比較值PC 組與B 組比較值tD 組與A 組比較值PD 組與A 組比較值0.241±0.025 0.352±0.031*0.591±0.021 0.204±0.031 12.635＜0.05 25.819 0.000 14.273 0.000 23.111 0.000 0.417±0.029 0.446±0.021*0.721±0.023 0.311±0.019 11.058＜0.05 18.365 0.000 19.434 0.000 30.731 0.000 0.511±0.032 0.581±0.011*0.784±0.035 0.293±0.018 10.117＜0.05 12.872 0.000 12.373 0.000 27.896 0.000 0.516±0.018 0.409±0.019 0.384±0.033 0.582±0.026 9.869＜0.05 7.852 0.000 1.468 0.180 10.538 0.000 0.281±0.029 0.322±0.018*0.433±0.029 0.217±0.023 13.386＜0.05 8.287 0.000 7.272 0.000 13.049 0.000 0.181±0.021 0.252±0.033*0.328±0.019 0.095±0.018 14.362＜0.05 11.607 0.000 14.630 0.002 19.907 0.000

圖4 各組細胞的凋亡情況

表2 HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率的相關性分析

HIF-1α 是Semenza 等于20世紀90年代發現的一種細胞內重要因子，其參與了體內的許多生物學過程，起到維持細胞、組織在低氧條件下的內部環境的穩定，從而使細胞適應此種低氧的環境[8-10]。間盤組織中因為沒有血管，因此營養只能是通過終板和纖維環的途徑來進行傳遞。隨著人的機體老化以及某些病理的因素，終板軟骨組織逐漸出現鈣化，因此氧氣等營養物質的供應路徑受到阻塞，致使椎間盤組織內的低氧狀態愈加嚴重。相關文獻報道[1]，椎間盤組織中的髓核細胞正是處于這種低氧濃度的組織環境之中，因此可以誘導髓核細胞通過某個途徑來表達HIF-1α，進而以達到使整個間盤組織能夠適應這種低氧濃度的組織內環境，但也有相關實驗表明HIF-1α 的過度表達也可能起反作用，加速間盤組織的退變過程[5]。目前，在對軟骨細胞的研究中也發現HIF-1α 對其具有調節作用[11]，髓核細胞與軟骨細胞屬于同源細胞，具有很高的相似性，髓核細胞也是主要靠無氧代謝過程來獲取其代謝所需的能量[12]。有研究[13-14]表明，髓核細胞處于間盤這種低氧濃度的環境之中，可以促使髓核細胞表達HIF-1α，而HIF-1α 洽是這種細胞內的重要調節因子，從而使間盤組織中的細胞適應這種低氧濃度環境。在這個過程中其參與了間盤組織的營養代謝，血管的形成，以及髓核細胞凋亡和分化等重要環節[15]。

以往的研究[16]表明，HIF-1α 可以通過多種方式和途徑以使細胞適應生存于這種低氧濃度的環境。Moritz 等[17]的研究說明，HIF-1α 可使脾細胞能夠在生長代謝過程中適應低氧條件，但是其研究也說明當低氧刺激過大時HIF-1α 反而可以導致細胞的凋亡。退變間盤組織中的氧濃度更低，退變間盤組織中測得的氧分壓明顯低于正常的間盤組織。文獻報道[3]在臨床手術中所得的人突出間盤中，其間盤的突出程度不同，測得的HIF-1α 的表達程度也明顯不同，同樣測得的髓核細胞凋亡程度也明顯不同，其二者的相關性分析結果表明二者之間存在高度相關性。筆者在之前的研究中證明了大鼠的髓核細胞中HIF-1α 過度表達可以導致原代培養的髓核細胞凋亡的增加，因此筆者認為在一定情況下HIF-1α 是髓核細胞發生凋亡的一個誘因。細胞凋亡是細胞的程序性死亡過程，其發生過程受到一定程度的調控，HIF-1α 可以通過一定的調節過程來影響凋亡相關基因在細胞內的表達，最終可能造成細胞凋亡[18]。近些年來研究的重點集中于HIF-1α 在腫瘤細胞凋亡中的作用及機制，相關研究證明HIF-1α 可以在細胞內通過某些調節機制從而激活能促進細胞發生凋亡的分子、或者是能夠抑制抗凋亡的相關分子的表達，從而達到促發細胞凋亡的一系列信號轉導機制，最終使細胞發生程序性死亡，這個過程就是所說的基因調控機制，其最終的結果就是通過一個共同的路徑影響細胞的程序性死亡過程[19]。調控細胞發生凋亡的分子有很多，如Bcl-2 家族、細胞周期蛋白或其他調節分子。本研究分析HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率的相關性，結果顯示，HIF-1α、p53、Bax、Bcl-2 及caspase3 變化與凋亡率均呈正相關性（P＜0.05）。p53 是一種抑癌因子，研究表明，在低氧條件下，低氧誘導因子突變型肝癌細胞不能增加p53 的表達，而野生型則可以促進p53 表達，并可以發現有大量的肝癌細胞發生程序性死亡[20]。Greijer 等[21]的研究表明，p53 基因敲除后低氧促發的細胞凋亡明顯受到抑制。而對于在髓核細胞中HIF-1α是通過哪些方式來促進細胞凋亡卻沒有定論，本實驗通過調控HIF-1α 蛋白的表達并同時測定p53、Bcl-2、Bax、caspase3 蛋白的表達情況，提示了HIF-1α 表達與髓核細胞的線粒體凋亡路徑有一定相關性，但具體的作用機制尚不清楚，需要進一步的實驗證明。

4 小結

HIF-1α 表達程度的增加可以誘發髓核細胞的凋亡程度也相應提高，從而說明了HIF-1α 可以通過某種機制促發髓核細胞凋亡。通過HIF-1α 不同表達程度下檢測線粒體凋亡路徑中相關因子p53、Bax、Bcl-2、caspase3 的表達情況，說明了HIF-1α 與這些蛋白表達的相關性，也預示了HIF-1α 對SD 大鼠髓核細胞線粒體凋亡路徑的影響作用。