CmWRKY15-1通過水楊酸信號通路調控菊花白色銹病抗性

畢蒙蒙，劉迪，高歌，祝朋芳,2，毛洪玉,2

通過水楊酸信號通路調控菊花白色銹病抗性

畢蒙蒙1，劉迪1，高歌1，祝朋芳1,2，毛洪玉1,2

1沈陽農業大學林學院，沈陽 100866；2遼寧省林木遺傳育種與培育重點實驗室，沈陽 100866

【】菊花白色銹病是菊花重要病害之一，嚴重影響其觀賞品質。分析在菊花抗白色銹病中的功能及防衛機制，為利用分子育種解決菊花產業中白色銹病病害問題提供借鑒。以菊花白色銹病抗病品種‘黃鶯’為試驗材料，構建過表達載體與干擾載體，通過農桿菌介導法轉化菊花，分別獲得超表達與沉默植株株系，通過表型觀察、病情指數統計及轉基因植株內源SA含量變化、SA合成關鍵基因及病程相關基因的表達分析，探究在水楊酸信號途徑響應菊花白色銹病的功能。經遺傳轉化后獲得超表達植株OE-9株系與沉默植株RNAi-4株系，接種后的表型鑒定和病情指數調查中RNAi-4株系病情指數為53.67，抗性反應表現為感病，而野生型植株接菌前后表型無變化，表明的沉默降低了‘黃鶯’對白色銹病的抗性。同時OE-9株系中內源水楊酸含量在接種前后與WT相比呈上升趨勢，而RNAi-4株系中水楊酸含量降低，即的過表達與沉默分別顯著上調和下調內源SA含量，對SA的積累有正向調節作用。OE-9系、RNAi-4系和WT在接菌處理前后的SA合成基因表達情況分析結果表明，在接種處理后，OE-9株系中的表達呈先增加后降低的趨勢，其最高表達量為對照的3.8倍。而在RNAi-4株系中，在接種后出現降低，且一直保持較低水平。在OE-9株系中的表達相較于對照增加，其最高表達量為對照的2.3倍，而在RNAi-4株系中，該基因的表達總體呈下降趨勢，這與SA含量測定的變化結果基本一致，也進一步驗證通過SA介導的信號途徑響應菊花白色銹病。此外，響應SA信號的病程相關基因表達分析結果顯示，隨著白色銹病病原菌處理時間的延長，OE-9株系中這些基因的表達除外，均在40 h時出現峰值，相對延后，在48 h時出現峰值。RNAi-4株系中除外，其他基因的表達量顯著低于WT、OE-9中的表達量。的過表達提高了水楊酸信號途徑中的轉錄水平，與此相反，的沉默使這些基因表達下調。對菊花抗白色銹病具有正調控作用，且通過水楊酸介導的信號途徑調控抗病。

菊花；；白色銹?。凰畻钏?；功能驗證

0 引言

【研究意義】菊花（）是菊科菊屬的多年生草本花卉，是我國傳統名花，具有較高的觀賞與經濟價值。菊花白色銹病由堀氏菊柄銹菌（Henn.）引起，屬冬孢菌綱、銹菌目，主寄生菌，是活體營養型病原菌，專性寄生于菊屬（spp.）植物，被列為世界性檢疫病害[1-2]。該病主要集中于受害植株的葉和莖等觀賞部位，葉背出現壞死斑，似蟾蜍皮狀，葉片褪綠、卷曲，后逐漸發展為變色、腐爛、干枯，甚至全株死亡[3]。菊花白色銹病在我國菊花產業里傳播蔓延，感病品種遭受毀滅性傷害，降低了菊花產品的觀賞價值與商業品質，嚴重影響了菊花在國際市場上的進出口生產。同時多數的生產基地由于加大了控制該病的人力與物力，而導致成本費用增加。目前基于分子手段發掘菊花WRKY類抗白色銹病相關基因的功能研究較少。因此，亟待獲得有潛力的抗性基因進行抗白色銹病分子育種?！厩叭搜芯窟M展】WRKY轉錄因子作為植物抗病反應中參與信號傳遞途徑及基因表達過程的重要調控基因，在挖掘目標基因與基因功能分析的研究領域應用廣泛[4]。大量研究證明，WRKY參與了抵抗擬南芥白粉病、番茄葉卷病及灰霉病、黃瓜霜霉病、蘋果輪紋病、棉花大麗輪枝菌、柑橘潰瘍病、芍藥細極鏈格孢菌[5-12]等多種植物病害。在菊花中，可有效抑制蚜蟲種群的增長，增強菊花對蚜蟲的抗性[13]，增加了對黑斑病的敏感性[14]。WRKY轉錄因子可以調控如脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、茉莉酸/乙烯（JA/ET）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等多種植物生物過程信號網絡[15]。水楊酸作為一種信號分子，在植物體內可轉移并誘導植物抗性，植物在病原物侵染后，首先識別該應激信號，啟動植物體內的防御反應，促進SA的合成，與此同時激活下游基因的表達，通過信號傳遞誘導植物產生病程相關蛋白（PRs蛋白）調節相關保護酶如超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等清除細胞活性氧，使植物局部獲得抗性，進而阻止病原物的進一步入侵[16-18]。歐芹[19]、辣椒[20]、煙草[21]、毛果楊[22]等研究中的WRKY轉錄因子能調節SA介導的信號通路中類基因的表達，從而改變植物的抗病性，表明WRKY轉錄因子可參與SA途徑以調節植物的防御反應。筆者課題組前期對菊花感、抗品種進行轉錄組測序[23]，獲得了差異表達基因，菊花‘黃鶯’接種白色銹病病原菌后，的表達量上調，且該基因受SA、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ETH）等激素誘導表達，說明該基因與菊花抗病性相關，且抗病過程受激素信號介導。通常，SA信號是針對生物活體型營養型病原體的抗性反應，例如新番茄粉孢菌（）和經霜霉病菌（）等活體營養型病菌[24]，而JA/ET信號則是針對壞死病原體[25]?！颈狙芯壳腥朦c】菊花白色銹病病原菌（Henn.）是由崛氏菊柄銹菌引起的真菌，為活體營養型病菌，因此，推測菊花對抗此病原菌可能是通過SA介導的抗病通路。近年來，在研究響應菊花白色銹病侵染的轉錄組方面普遍開展了研究，但目前尚無報道明確指出某個基因對菊花白色銹病有調控作用，有待深入研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究以菊花白色銹病抗病品種‘黃鶯’為試驗材料，利用前期克隆獲得的序列，構建植物表達載體與干擾載體轉化菊花，通過基因超表達與沉默的方法驗證在菊花抗白色銹病中的功能，為進一步研究其抗白色銹病的分子機理提供借鑒。

1 材料與方法

試驗于2018—2020年在沈陽農業大學林學院進行。

1.1 材料與菌株

菊花白色銹病抗病品種‘黃鶯’組培苗取自沈陽農業大學林學院組培實驗室。超量表達載體pBI121-、干擾載體RNAi-由實驗室前期構建。

1.2 pBI121-CmWRKY15-1與RNAi-CmWRKY15-1載體的轉化

RNAi-載體是選擇RNAi質粒pHANNIBAL中的PDK內含子，形成發夾結構，并最終構建到pBI121質粒中進行后續轉化。將含有重組質粒pBI121-與RNAi-的農桿菌菌液從-80℃超低溫冰箱中取出，進行菌株的活化，并擴大培養至OD600=0.5—0.6，作侵染液備用，并使用農桿菌介導法轉化[26-27]。

取苗齡為4周左右，生長良好的‘黃鶯’組培苗，切成0.5 cm×0.5 cm的方形葉盤，預培養（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA）2 d，菌液侵染時濃度OD600=0.5—0.6，稀釋50倍，侵染7 min，共培養（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA）2 d，延遲培養（MS+0.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+200 mg·L-1Cef）2 d后，轉接至篩選培養基（MS +0.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+200 mg·L-1Cef+20 mg·L-1Kan）上，每15 d更換一次培養基，直至產生抗性芽后接種于生根篩選培養基（MS+20 mg·L-1Kan）中。

1.3 轉基因植株的鑒定

取經過抗生素Kan篩選的陽性植株幼嫩葉片，提取DNA。根據pBI121載體上35S啟動子特異引物Ⅱ抗性基因設計鑒定引物（表1），進行PCR擴增，檢測是否能夠得到目的條帶。同時試劑盒提取RNA，并反轉錄成cDNA，作RT-PCR分析。以菊花為內參基因，以已鑒定陽性條帶的植株cDNA為模板，設計定量檢測引物-F/R（表1），通過qRT-PCR法測定的表達，每個樣品設有3次重復，采用2-ΔΔCT法分析結果，同時采用半定量方法加以輔證。

表1 定量所需引物

1.4 白色銹病病原菌的接種

選取6—8葉期的長勢良好的組培苗OE-9系、RNAi-4系及WT，無菌水中平衡2周，移栽于口徑21 cm花盆中，放置組培室中培養2周。制備菌液、接種方法及接種后的植株培養條件參考文獻[28]。選取植株OE-9系、RNAi-4系頂端往下第2—5位葉進行接種處理，每個株系處理15株，接種兩周左右，觀察RNAi-4系及WT植株發病情況，并拍照記錄。

分別對OE-9系、RNAi-4系及WT于接種的0、16、24、40、48、64和72 h取樣，設置3個重復。

1.5 RNAi-4系植株接種白色銹病病原菌后病情統計

本研究參照Zhu等[29]和Wang等[30]對菊花白色銹病的病害分級標準與菊花白銹病抗性鑒定標準，計算RNAi-4系植株病情指數（disease severity index，DSI）以及對該植株表型進行抗性鑒定。

1.6 內源SA含量測定

選擇OE-9系及WT系接種0和24 h的葉片進行樣本取材，選取植株頂端往下第3—4位葉，約30—100 mg。水楊酸測定試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）[31]。激素結果（ng?g-1）=5*C*M/m/1000。式中，C：由標準曲線算得樣品含量濃度（pmol?L-1）；M：物質平均相對分子質量（g?mol-1）；m：樣品鮮重（g）。

1.7 SA合成關鍵基因ICS1、PAL的表達分析

以采取的樣本cDNA為模板，使用、熒光定量引物（表2），對其表達量進行qRT-PCR測定。

1.8 病程相關基因NPR1、PR1、PR2、PR5等的表達分析

使用、、、熒光定量引物（表2），對其表達量進行qRT-PCR測定。

1.9 數據處理與統計分析

試驗數據采用Excel 2013進行整理，使用SPSS Statistics統計分析軟件進一步檢驗分析。

2 結果

2.1 超表達植株與沉默植株的獲得

經過Kan篩選分別獲得18株和19株抗性植株，提取抗性苗葉片DNA，以pBI121質粒上35S啟動子特異引物Ⅱ抗性標記基因序列設計引物，進行PCR鑒定，電泳（圖1-a，1-b）結果顯示，有8株轉pBI121-與RNAi-載體的抗性植株均在678 bp處擴增出與陽性對照一致的條帶，而陰性對照未見對應條帶，表明質粒已基本整合到菊花‘黃鶯’組培苗基因組中。

將PCR鑒定出的陽性植株進行半定量檢測，結果表明，在轉基因株系中均有不同程度的表達，且均高于野生型植株（圖2-a）。與未轉化植株WT相比，各干擾植株中的表達水平均有不同程度的下降，下調幅度達46%—79%，表明干擾表達載體成功在干擾植株中發揮作用（圖2-b）。

qRT-PCR結果顯示，過表達植株中9號的表達量最高，約為野生型植株的25倍，7號與13號次之，分別為13倍和12倍，與半定量結果一致（圖3-a）。干擾植株中的表達量降低幅度最大為WT的79%，最小為46%，其余集中在24—40%（圖3-b）。

表2 定量所需引物

a：pBI121-CmWRKY15-1 PCR電泳，1—18：pBI121-CmWRKY15-1抗性植株。b：RNAi-CmWRKY15-1 PCR電泳，1-19：RNAi-CmWRKY15-1抗性植株。M：DNA marker；W：野生型；P：陽性對照。下同

圖2 CmWRKY15-1表達水平的半定量檢測

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 RNAi-4系植株接種白色銹病病原菌后表型鑒定

對RNAi-4系、WT植株各接種處理15株，每株處理4—5個葉片，分為3組。RNAi-4系及WT植株在接菌后置于培養室觀察。如圖4所示，接種14 d后RNAi-4系植株葉片表現為葉背的冬孢子堆明顯，數量多且個體小，對應葉面病斑明顯。少數葉面有少量的淡黃斑且凹陷，背部偶有不連續的冬孢子堆，數量少且大。而WT植株接種后無感病癥狀，即與未接種時相比無變化。對RNAi-4的病情指數（DSI）統計，發現RNAi-4系的DSI為53.67，抗性鑒定表現為感?。⊿）。以上結果表明，的沉默使菊花對白色銹病的抗性減弱，敏感性增強。

2.3 OE-9系中內源SA的含量

如圖5所示，未接菌時，WT的內源SA含量為47.81 μg·g-1，OE-9系的內源SA含量比野生型WT高，為57.99 μg·g-1；OE-9系中的內源SA含量大約是WT系的1.21倍。在白色銹病病菌接種24 h后，OE-9系的內源SA含量增加，為97.78 μg·g-1，WT的內源SA也相較于未接菌時增加，為56.33 μg·g-1，約是WT的1.73倍。而RNAi-4系在接種前SA含量與OE-9系無明顯差別，接種24 h后，其含量下降，為對照的59%。綜上，的過表達與沉默分別顯著上調和下調SA含量，即對SA的積累有正向調節作用。

R1和R2：RNAi-4系接種的第3位葉的葉面與葉背；W1和W2：野生型接種第3位葉的葉面與葉背

WT：‘黃鶯’野生型植株；OE-9：超表達植株；RNAi-4：沉默植株。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.4 OE-9系和RNAi-4系中ICS1、PAL的表達分析

為了進一步驗證是通過SA介導的信號途徑來響應菊花白色銹病的猜測，對OE-9系、RNAi-4系和WT在接菌處理前后不同時間點的SA合成基因表達情況進行分析。如圖6所示，處理后，WT中的表達在40和64 h的表達水平較高，OE-9株系中，的表達呈先增加后降低的趨勢，在40 h時其表達量為WT的1.67倍，48 h時為3.8倍。RNAi-4株系中的表達在接種后出現降低且一直保持在較低水平。OE-9株系中的表達呈先上升后下降的趨勢，處理24 h后其表達保持較高水平，其中24 h時的表達量為對照的2.3倍。RNAi-4株系中的表達整體呈下降趨勢，一直低于WT，與SA含量測定結果基本一致。

圖6 ICS1、PAL的表達分析

2.5 OE-9系和RNAi-4系中NPR1、PR1、PR2、PR5的表達分析

在接種前，響應SA信號的病程相關基因在轉基因株系和野生型株系中的表達量相差不大。隨著白色銹病病原菌處理時間的延長，在OE-9株系中響應SA信號的這些基因分別在不同時間出現峰值，、均在40 h時達到峰值（圖7-a和圖7-b），而相對延后，在48 h時出現峰值。相比WT，這4個基因均有不同程度的增加（圖7-c和圖7-d）。在RNAi-4株系中除外，其他基因的表達量均顯著低于WT、OE-9中的表達量，且、的表達隨著病菌處理時間的延長呈現下降的趨勢，處理40 h時，表達量僅為對照的1.04 %，表達量約為對照的1.73 %（圖7-a和圖7-c）。

圖7 NPR1、PR1、PR2、PR5的表達分析

3 討論

在整個RNAi過程中，dsRNA的選擇和設計至關重要，可直接影響RNAi技術的高效性及特異性[32]。根據已有研究中報道的通過人為設計dsRNA或自我互補的發夾RNA（iphRNA）導入植物，可誘導啟動植物體內的RNA沉默[33-34]，本研究選擇長度為300 bp的特異性片段作為干擾片段，RNAi載體pHANNIBAL中的PDK內含子構建發夾結構，進行的干擾。為保證表達載體在細胞中可以持續產生siRNA以達到長久抑制靶細胞mRNA的目的，將iphRNA最終構建到植物常用且高效的表達載體pBI121中進行后續轉化。在載體的構建過程中，綜合考慮質粒pHANNIBAL、pBI121的多克隆酶切位點，以及發夾結構形成，在設計干擾片段引物時引入酶切位點I，在反義片段中引入酶切位點I，并在測序時，保證酶切位點未發生堿基突變。qRT-PCR測定干擾植株中的相對表達量主要集中在對照（WT）的0.2—0.4倍，本試驗選擇RNAi-4進行擴繁，作為后期功能驗證材料。

植物的防御體系是一個復雜的信號調節網絡，植物激素在這個信號網絡中起著重要的作用，例如水楊酸（SA）信號通路，茉莉酸/乙烯（JA-ET）信號通路[35-36]。WRKY-TFs是SA、JA和ET信號通路中重要的調控節點，通過這些信號通路參與植物防御[37]。本研究中，RNAi-4株系的沉默導致抗病品種‘黃鶯’對白色銹病的抵抗力降低，表現為感病，表明對菊花抗白色銹病具有正調控作用。前期的研究發現，SA、MeJA、ETH 3種外源激素均能誘導菊花葉片中的表達，而ABA處理后，的表達沒有明顯改變。由此推測，可能參與SA、MeJA、ETH 3種激素介導的抗病途徑。在SA介導的信號通路中，由正向調控其下游的來獲得抗性[38]，植物防御基因在JA-ET所介導的信號通路起重要作用，是植物抗病的標記基因[39]。利用qPCR技術分析轉基因植株中JA-ET信號途徑中抗病標志基因的表達情況，結果表明，無論是超表達植株還是沉默植株中的表達與對照相比均無明顯變化。與此同時，在接菌處理后，OE-9系中的SA含量增加，RNAi-4系中SA含量降低也驗證了該猜測。另外，的超表達也促進了SA合成途徑關鍵基因的表達，而的沉默則表現相反結果，這與SA含量的變化一致。由此證明通過SA信號轉導途徑參與菊花抗病。另外，在病菌侵染后，SA信號途徑的病程相關基因在OE-9系中均表達上調，特別是、，而在RNAi-4植株中表達下調。Chen等[40]研究的過表達擬南芥在丁香假單胞菌侵染后，激活了表達從而提高了轉基因擬南芥對丁香假單胞菌的抗性，表明在植物抗丁香假單胞菌侵染調節中起正調控作用。Tang等[41]通過酵母單雜分析發現轉錄因子能夠與、等基因結合，提高部分的表達，增強植物對炭疽病的抵御能力。的沉默使其相關抗病標志基因、、、、和的表達下調，增強了轉基因植株對大麗花黃萎病的敏感性，揭示正調控棉花的抗性[42]。本研究與上述結果一致，在參與菊花白色銹病病菌抗性調節中起正調控作用，且通過SA信號通路調控但在SA信號通路中與直接作用還是作用于其他靶基因，仍需進一步研究。

4 結論

的過表達增加了內源SA含量并促進了SA合成途徑關鍵基因的表達，而的沉默與之相反。響應SA抗病信號的基因表達分析顯示，OE-9系中表達量高于同樣病菌處理的WT，特別是、；而在RNAi-4系中的表達量低于WT。即對菊花抗白色銹病具有正調控作用，且通過SA介導的信號通路在菊花抵抗白色銹病病菌侵染過程中發揮作用。

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Regulates Resistance of Chrysanthemum White Rust Through Salicylic Acid Signaling Pathway

BI MengMeng1, LIU Di1, GAO Ge1, ZHU PengFang1,2, MAO HongYu1,2

1College of Forestry, Shenyang Agricultural University, Shenyang 100866;2Key Laboratory of Forest Tree Genetics, Breeding and Cultivation of Liaoning Province, Shenyang 100866

【】Chrysanthemum White Rust is one of the most important diseases of chrysanthemum, which seriously affects its ornamental quality. This study would provide theoretical reference for the molecular mechanism of Chrysanthemum White Rust through the preliminary analysis of the function of.【】In this study, the overexpression and interference vector was constructed based ongene sequence, which were transformed into resistant cultivar Huangying bymediated method. The function ofgene in response to Chrysanthemum White Rust in salicylic acid signal pathway was explored by phenotype observation, disease index statistics, changes of endogenous SA content in transgenic plants, expression analysis of key genes of SA synthesis, pathogenesis-related genes and defense enzyme genes.】The OE-9 and the RNAi-4 strains were obtained after transformation. The disease index of RNAi-4 strain was 53.67 in phenotype identification and disease index investigation, and the resistant response was susceptible, but the phenotype of wild type plants had no change. Meanwhile, the content of endogenous Salicylic Acid (SA) in OE-9 lines increased, compared with WT after inoculation, while in RNAi-4 lines decreased. The overexpression and silencing ofsignificantly changed SA content, which had a positive regulatory effect on SA accumulation. The expression of SA synthesis genes in OE-9, RNAi-4 and WT showed that the expression ofin OE-9 upregulated first and then down-regulated, and the highest expression was 3.8 times as much as that in WT. Whereas, the expression level ofin RNAi-4 decreased after inoculation and remained at a lower level. Theexpression indicated an increasing trend, and the highest expression was 2.6 times as much as that of the control.expression in RNAi-4 was down-regulated, basically consistent with the change of SA content, which further confirmed thatwas a novel regulator mediated by SA signal pathway in respond to Chrysanthemum White Rust. In addition, the analysis of the expression of disease resistance related genes in response to SA signal showed that the expression of these genes peaked at 40 h in OE-9. However, thewas relatively delayed and peaked at 48 h, and their expression in RNAi-4 was significantly lower than that in WT and OE-9 except. The overexpression ofincreased the transcription level ofgene in SA signaling pathway. On the contrary, the silencing ofreduced the expression of these genes.【】Therefore,had a positive regulatory effect on resistance of Chrysanthemum White Rust, and it might respond to Chrysanthemum White Rust through the regulation of SA signal pathway.

chrysanthemum;gene; ChrysanthemumWhite Rust; SA; functional verification

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.03.015

2020-05-04；

2020-07-13

國家自然科學基金（31972447）、國家重點研發計劃（2018YFD1000400）、遼寧省自然科學基金（2019-ZD-0707）

畢蒙蒙，E-mail：1262665213@qq.com。通信作者毛洪玉，E-mail：maohongyu@syau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）