2015—2019年上海地區25-羥基維生素D室間質量評價結果分析

方慧玲， 葛丹紅， 朱宇清， 朱嶺峰， 趙曉君， 陳子齊， 王梓蒙

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

維生素D是一類脂溶性類固醇激素，通過調節腸鈣吸收和腎臟重吸收維持鈣平衡。隨著人口老齡化和疾病譜的改變，維生素D作為維持生命活動所必需的一類有機物質，其主要作用已經從傳統應用范疇擴展到心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤等各類疾病的治療中[1-3]，具有減輕胰島素抵抗、調節免疫、移植細胞增殖、促進細胞分化、抗炎性反應及抗纖維化等非骨骼系統作用[4-6]。生理狀態下，人體血液中維生素D的主要形式是25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]，是評價維生素D營養狀態的最佳指標。

隨著維生素D的功能被不斷深入地認識，臨床對25（OH）D的檢測需求也日益增加，檢測質量日益受到重視，商品化25（OH）D檢測試劑盒種類也越來越多。常用的25（OH）D檢測試劑盒的檢測原理包括全自動化學發光法、電化學發光法、酶聯免疫吸附試驗，還有一些實驗室自建的液相色譜串聯質譜法。有研究發現，不同方法檢測25（OH）D的結果差異顯著[7]。檢測結果不同將直接影響到臨床醫生對患者體內維生素D水平的判斷[8]，因此如何做好25（OH）D的檢測質量控制，成為質量保證的重點。

室間質量評價（external quality assessment，EQA）是由實驗室外部的某個獨立機構按照預先制定的準則，利用實驗室間的結果對參評實驗室進行檢測能力評價的活動[9]。上海市臨床檢驗中心（Shanghai Center for Clinical Laboratory，SCCL）是獲得中國合格評定國家認可委員會認可的臨床檢驗質量控制組織評價機構。SCCL每年按計劃向各實驗室發放未知樣本，對檢驗人員的技術水平進行考核，并對檢測結果進行評價，2015年開始開展25（OH）D項目的EQA活動。本研究主要針對上海地區醫學實驗室2015—2019年EQA 25（OH）D檢測結果進行分析，以了解上海地區25（OH）D的檢測質量，為該項目的標準化提供參考。

1 材料和方法

1.1 EQA樣品準備

2015—2019年25（OH）D EQA樣品均為商品化質控品，其中2015、2016年EQA樣品購自英國朗道公司，2017、2018、2019年EQA樣品購自美國伯樂公司。該項目所有質控品均為經處理的人源血清制備的血清樣品。所有樣品發放前均按照能力驗證提供者認可準則（CNASCL03：2010）[10]要求進行均勻性和穩定性評價，確保每個參評實驗室都收到具有可比性的能力驗證樣品，并且在整個能力驗證過程中保持穩定。所有EQA質控品均在2～8 ℃條件下運輸和保存。

1.2 方法

1.2.1 EQA方案設計 25（OH）D 項目的EQA計劃設計在內分泌組，各質控品由SCCL統一時間發放，每年2次，每次發放5水平樣品。各實驗室按說明書要求復溶后，按日常患者檢測樣本處理方式處理，由日常工作人員使用實驗室常規檢測系統（儀器、試劑和方法等）檢測，檢測次數應與常規檢測患者樣本的次數相同。檢測結束后按照要求上報結果。

1.2.2 結果評價與分析 根據SCCL能力驗證項目統計方案對上報數據進行統計處理。EQA統計分析以參加者的公議值為指定值。上報數據根據檢測儀器進行分組，分別為瑞士羅氏公司（簡稱羅氏）、意大利索靈公司（簡稱索靈）、深圳新產業公司（簡稱新產業）、深圳邁瑞公司（簡稱邁瑞）、德國西門子公司（簡稱西門子）、美國雅培公司（簡稱雅培），剔除粗大誤差后進行統計學分析。上報數據中明顯的錯誤結果（單位換算、小數點、計算等粗大誤差）由專家識別，并且計算合計統計量時剔除該值，但這些結果仍在能力驗證計劃中予以評價。25（OH）D項目的能力評定標準為靶值±25%，參評實驗室某一樣品檢測結果在能力評定標準范圍內，則該樣品檢測結果為滿意。1次能力驗證活動參評實驗室單個項目的5個樣品檢測結果至少80%達到滿意，則該項目為合格，某一項目的得分計算公式為：該項目的可接受結果數/該項目總測定樣品數×100。本研究其他數據分析采用SPSS 20.0統計軟件完成，對不同分組樣本進行Mann-Whitney Wilcoxon檢驗和Kruskal-Wallis檢驗，不同年度單項目合格率進行Pearsonχ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗室回報情況

參加SCCL EQA活動的實驗室包括上海地區開展該項目的各級各類醫療衛生機構檢驗科、臨床實驗室、醫學實驗室以及儀器、試劑生產企業實驗室和獨立實驗室。2019年共83家參評實驗室上報25（OH）D檢測結果，除1家采用酶聯免疫吸附試驗外，其他82家均為化學發光發和電化學發光法；有85.54%的實驗室使用進口檢測系統檢測25（OH）D。見表1。

2.2 實驗室檢測能力評價

SCCL 2015—2019年開展10次25（OH）D EQA活動，發放不同濃度水平樣品50份。參評實驗室從2015年第1次的41家逐年增加到2019年第2次的83家，增加了102.4%。參評實驗室的檢測方法包括化學發光法、電化學發光法、酶聯免疫吸附試驗、熒光免疫法、液相色譜串聯質譜及其他方法。2015年第1次EQA 27家合格、5家不合格、9家不評價，單項合格率為65.8%（27/41）；2019年第2次EQA 77家合格、1家不合格、5家不評價，單項目合格率為92.8%（77/83）。見表2。

表2 2015—2019年上海地區25（OH）D EQA合格率

根據2015—2019年25（OH）D EQA上報數據剔除粗大誤差后總體均值（）、標準差（s）和變異系數（coefficient of variation，CV）等統計量（表3），對不同檢測批次的EQACV作Wilcoxon符號秩和檢驗和Kruskal-Wallis檢驗，不同年度25（OH）D檢測結果CV差異有統計學意義（P＜0.000 1）。2019年EQA數據按照檢測方法分為化學發光法、電化學發光法、酶聯免疫吸附試驗3個組，除1921、1922 2個批次外，其他批次樣品不同方法檢測結果差異均有統計學意義（P＜0.05）。2019年不同儀器組EQA數據統計結果見表4、表5。

表3 2015—2019年25（OH）D EQA數據（剔除后）

表4 2019年25（OH）D項目第1次EQA數據（剔除前）

表5 2019年25（OH）D項目第2次EQA數據（剔除前）

2.3 不同儀器組檢測結果與液相色譜串聯質譜法的比較

2015—2019年，23個批次EQA質控品用液相色譜串聯質譜法進行檢測，檢測結果見表6。

表6 2015—2019年23個批次EQA質控品的質譜檢測數據

以液相色譜串聯質譜法檢測值作為參考值，對應批次的EQA上報數據根據檢測儀器進行分組，比較組內均值和參考值，計算偏移，計算公式為：偏移=（組內均值-參考值）/參考值，實驗室數＜2時直接使用原始數據進行比較。各儀器組（實驗室數＞2家）與液相色譜串聯質譜法檢測結果的差異見圖1。

圖1 各儀器組均值與液相色譜串聯質譜結果的偏移

3 討論

我國人群維生素D缺乏的情況廣泛存在[11]。隨著臨床對25（OH）D檢測需求的增多，檢測實驗室對25（OH）D的檢測質量也受到廣泛關注[12]。2010年，美國國立衛生研究院、美國疾病預防控制中心、美國國家標準和技術研究院和比利時根特大學合作，開始維生素D標準化計劃，以期解決維生素D檢測面臨的問題。美國病理學家協會組織的維生素D正確度驗證計劃數據顯示，能力驗證計劃對實驗室維生素D檢測能力的提升起到了良好的促進作用[13]。SCCL也于2018年開始開展基于液相色譜串聯質譜法的EQA和正確度驗證計劃。本研究結果顯示，上海地區醫學檢測實驗室25（OH）D 項目的EQA合格率從2015年的65.8%上升到2019年的92.8%，單項合格率顯著提高。從每年EQA數據的CV中位數看，上海地區醫學檢測實驗室對25（OH）D的檢測離散程度逐漸變小，提示各實驗室間檢測能力一致性有所提高。對不合格的結果進行分析，推測不合格原因主要有以下幾個方面：（1）質控品運輸和保存時，出現嚴重偏離正常保存條件的情況，導致質控品變質；（2）實驗室人員未嚴格按說明書要求進行樣品復溶；（3）上報錯誤，如未進行單位換算或質控品編號混淆及填寫錯誤；（4）儀器/方法的性能變化，如儀器故障等。實驗室應加強人員培訓及儀器維護，以提高檢測質量。

盡管25（OH）D項目EQA合格率在逐年提高，但不同檢測方法與檢測系統間的差異依舊存在。2019年10批次EQA樣品檢測數據間差異顯著（表4、表5），與之前的血清樣品的EQA結果一致[14]。結合廠家聲稱的試劑性能與檢測參考區間（表1）對結果進行分析，推測造成這一現象的原因除了不同系統本身存在的差異之外，還可能與本研究所選用的檢測樣品類型有關。本研究中所有樣品均為經處理的人源血清制備的血清樣品，廠家在制備過程中基于穩定性或凍干成形的要求可能添加了非血清來源的物質，從而使樣品基質發生改變。這些添加劑產生的基質效應可能導致了不同檢測系統間檢測結果的差異。本研究結果顯示，化學發光法的CV顯著高于電化學發光法的CV，除了方法學差異的影響外，還有可能是因為化學發光法組里包含了不同的儀器組，而電化學發光法只有羅氏組。化學發光法組中，盡管采用的方法相同，不同品牌抗體識別抗原表位的差異可能會導致檢測系統對25（OH）D的檢測能力出現差異，血液中其他維生素D代謝物或類似物的干擾也會導致檢測結果的差異。近年來，液相色譜串聯質譜法因可對目標化合物直接定量而逐漸成為“金標準”的檢測方法。本研究不同檢測系統檢測結果與液相色譜串聯質譜法的差異依舊存在，但隨著EQA的開展，部分檢測系統與液相色譜串聯質譜法的差異逐漸減小，檢測性能有所提升。本研究中液相色譜串聯質譜法、電化學發光法和熒光免疫法3種方法因使用的實驗室太少，其在EQA中的表現需要更多數據進行驗證。

本研究也存在一定的缺陷：一是本研究是對歷年EQA數據的回顧性分析，質控物檢測結果的差異并不能等同于常規檢測樣本的結果差異；二是質控物濃度不能完全覆蓋醫學決定水平，如2019年缺乏25（OH）D＜30 ng/mL的質控品，因此無法準確評價各檢測實驗室對低濃度25（OH）D的檢測能力。

隨著臨床對維生素D的應用的拓展，維生素D檢測的質量也越來越受重視。EQA作為一項質量保證活動，也是內部質量控制的有效補充，其結果也逐漸成為各國際組織、認可機構和政府管理部門對實驗室檢測能力進行監督評價的依據。我們希望通過EQA活動，發現實驗室檢測中存在的問題，并加以改進，以提高各醫學實驗室的25（OH）D檢測水平，逐步提高常規檢測的準確性和可比性，為檢測結果互認提供保證。