LC-MS/MS檢測血清25-羥基維生素D替代校準品基質(zhì)的選擇與評價

李冰玲， 程雅婷， 趙蓓蓓， 佘旭輝， 董 衡， 余木俊

（廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司 廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院，廣東 廣州 510005）

血清25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]水平常被用于評價人體維生素D的營養(yǎng)狀況。因自然界中維生素D的主要存在形式包括維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）2種，因此醫(yī)學實驗室采用25-羥基維生素D2[25-hydroxyvitamin D2，25（OH）D2]和25-羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3]的總和來反映體內(nèi)25（OH）D的水平。目前，醫(yī)學實驗室檢測血清25（OH）D的方法主要有免疫分析法和色譜質(zhì)譜法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因其靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢，被認為是檢測血清25（OH）D的“金標準”[1-3]。但與免疫分析法相比，LCMS/MS測定25（OH）D可選擇的商品化試劑盒有限，性能不一[4]，不能滿足實際檢測過程中對準確度、線性范圍等性能參數(shù)的要求，因此多數(shù)醫(yī)學實驗室采用自建方法開展檢測。醫(yī)學實驗室自建LC-MS/MS方法檢測25（OH）D[5-6]時，必須重視配制標準溶液所用的替代校準品基質(zhì)（空白基質(zhì)）的選擇與評價，若替代校準品基質(zhì)與血清樣本基質(zhì)有顯著差異，會產(chǎn)生基質(zhì)效應差異，導致待測物及其同位素內(nèi)標物在不同基質(zhì)中的色譜質(zhì)譜響應信號不一致，產(chǎn)生基質(zhì)互通性問題，影響檢測方法的準確度和精密度。因此，選擇合適的替代校準品基質(zhì)，并對其與血清樣本基質(zhì)的互通性進行全面、合理的評價，對醫(yī)學實驗室自建準確、可靠的LCMS/MS方法檢測25（OH）D至關重要。本研究對LC-MS/MS檢測25（OH）D替代校準品基質(zhì)進行了系統(tǒng)、全面的評價。文獻報道的LCMS/MS檢測25（OH）D的替代校準品基質(zhì)有3%～8%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液或純?nèi)軇┗|(zhì)[7]。回顧已發(fā)表的文獻[5，8-9]，綜合考慮操作簡便、成本低等因素，本研究選擇對4% BSA和30%乙醇水作為備選替代校準品基質(zhì)進行評價。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集6份廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司表觀健康志愿者捐獻的人血清樣本，所有志愿者均知情同意；另收集10份2016年英國維生素D室間質(zhì)量評價計劃（Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS）[1，10]樣本，編號為486～490、496～500，DEQAS樣本基質(zhì)來源于接受放血治療的血色病或紅細胞增多癥志愿者；本研究所使用的25（OH）D2和25（OH）D3靶值由DEQAS提供，由美國國家標準與技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）參考測量程序賦值。

1.2 替代校準品基質(zhì)的配制及測定

1.2.1 替代校準品基質(zhì)配制 （1）4% BSA溶液。準確稱取40.0 g BSA粉末，采用pH7.5的磷酸鹽緩沖液溶解，并定容到1 L，配制成4% BSA溶液。（2）30%乙醇水溶液。準確移取30 mL無水乙醇溶液，采用去離子水定容到100 mL，充分混合，配制成30%乙醇水溶液。

1.2.2 校準物質(zhì)溶液和同位素內(nèi)標溶液配制 （1）分別準確稱取1.00 mg的25（OH）D2和25（OH）D3標準物質(zhì)，用0.50 mL無水乙醇進行溶解后，稀釋至12.5 μg/mL，配制成25（OH）D校準物質(zhì)溶液。（2）分別準確稱取1.00 mg d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3同位素內(nèi)標物質(zhì)，用1.00 mL無水乙醇進行溶解后，再用乙腈稀釋至50.0 ng/mL，配制成25（OH）D同位素內(nèi)標溶液。

1.2.3 標準曲線繪制 分別以4% BSA溶液和30%乙醇水溶液為基質(zhì)，將一定體積的25（OH）D2和25（OH）D3標準物質(zhì)溶液加入替代校準品基質(zhì)中，配制成濃度分別為2.20、3.13、6.25、12.50、25.00、60.00、100.00 ng/mL的標準溶液并繪制標準曲線。

1.2.4 樣本測定 參照文獻[11]的液液萃取樣本前處理方法，分別對實驗樣本進行前處理。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定。（1）液相條件。采用C18色譜柱（50.0 mm×2.1 mm），柱溫為50 ℃，進樣量為40 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸甲醇溶液，初始梯度為73%流動相B，2.4～3.1 min為92%流動相B，3.1～5.0 min恢復至初始梯度73%流動相B。（2）質(zhì)譜條件。采用正離子多反應監(jiān)測模式，25（OH）D2、25（OH）D3及其同位素內(nèi)標的離子對分別為413.4＞395.2、419.4＞401.3、401.4＞383.3、407.2＞389.4，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為450 ℃，碰撞能為13 V。

1.2.5 儀器及試劑 美國SCIEX公司API4000系列LC-MS/MS儀；標準物質(zhì)25（OH）D2（純度≥98.0%）、25（OH）D3（純度≥99.0%）、BSA、無水乙醇（色譜級）均購自美國Sigma-Aldrich公司[4]，同位素內(nèi)標物質(zhì)d6-25（OH）D2（純度≥99%）、d6-25（OH）D3（純度≥99%）購自美國Medical Isotopes公司[5]，室內(nèi)質(zhì)控樣品ClinChek Serum Control購自德國Recipe公司，甲酸（色譜級）購自美國CNW公司，甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、正己烷（色譜級）購自美國Merck KGaA公司。

1.3 替代校準品基質(zhì)評價實驗

1.3.1 同位素內(nèi)標在不同基質(zhì)中的響應值差異比較實驗 取4% BSA和30%乙醇水，2種替代校準品基質(zhì)的標準溶液各1組，按照樣本測定方法對6份不同來源的人血清樣本進行檢測，每個樣本各檢測1次，計算3種不同基質(zhì)中同位素內(nèi)標d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3的峰面積均值，并采用Kruskal-Wallis分析對多組變量進行相關性分析。

1.3.2 基質(zhì)效應混合實驗 取配制好的25（OH）D校準物質(zhì)溶液，分別用4% BSA和30%乙醇水進行稀釋，配制成30 ng/mL的溶液B（4%BSA基質(zhì)）和溶液C（30%乙醇水基質(zhì)）；6份不同來源的血清樣本編號為A1～A6，分別與溶液B、溶液C按不同比例混合，得到混合基質(zhì)樣本AB1～AB6、AC1～AC6。將A1～A6、溶液B、溶液C、AB1～AB6、AC1～AC6按照樣本測定方法進行檢測，每個樣本平行檢測3次，分別計算25（OH）D2和25（OH）D3的響應比值（響應比值=待測物峰面積/同位素內(nèi)標峰面積）；比較混合基質(zhì)樣本的25（OH）D2和25（OH）D3響應比值與混合前基質(zhì)響應比值的平均值之間的差異，若差異＜20%，則說明無相對基質(zhì)效應[6，12-13]，基質(zhì)效應驗證通過。

1.3.3 準確度評價實驗 取4% BSA和30%乙醇水，2種替代校準品基質(zhì)的標準曲線各1組，按照樣本測定方法檢測10份DEQAS樣本，每份樣本檢測1次，分別繪制2種基質(zhì)標準曲線的回歸方程，采用內(nèi)標定量法分別計算10份DEQAS樣本的濃度，并進行定量分析，將所得定量結果分別與DEQAS提供的靶值進行比較，計算相對偏移，并采用Passing-Bablok對數(shù)據(jù)進行相關性分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用MedCalc 15.2、GraphPad Pinsm 5.01和Excel2010軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示；采用Kruskal-Wallis分析進行多組變量的相關性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；采用Passing-Bablok進行2組數(shù)據(jù)的相關性分析。

2 結果

2.1 同位素內(nèi)標在不同基質(zhì)中的響應差異

d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3在4%BSA基質(zhì)中的響應值分別為（6.750±0.359）×105cps、（15.000±0.317）×105cps，與其在血清基質(zhì)中的響應值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3在30%乙醇水基質(zhì)中的響應值分別為（3.700±0.265）×105cps、（8.040±0.609）×105cps，與其在血清基質(zhì)中的響應值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

圖1 d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3在不同基質(zhì)中的響應值比較

表1 d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3在不同基質(zhì)中的響應值 ±s

表1 d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3在不同基質(zhì)中的響應值 ±s

d6-25（OH）D3/×105cps 4% BSA 7 6.750±0.359 15.000±0.317 30%乙醇水 7 3.700±0.265 8.004±0.609血清 6 6.580±0.667 15.000±1.080基質(zhì)類型 例數(shù) d6-25（OH）D2/×105cps

2.2 基質(zhì)效應混合實驗

混合樣本AB1～AB6的響應比值均在可接受范圍內(nèi)，說明4% BSA基質(zhì)與血清基質(zhì)之間無相對基質(zhì)效應。混合樣本AC1～AC6的響應比值結果中，AC5混合樣本的25（OH）D2響應比值與理論響應比值之間的相對偏移＞20%，說明30%乙醇水基質(zhì)與血清基質(zhì)之間存在相對基質(zhì)效應，基質(zhì)效應驗證未通過。見表2、表3、圖2。

圖2 混合樣本AB1～AB6、AC1～AC6響應比值與理論響應比值的相對偏移

表2 25（OH）D2基質(zhì)效應混合實驗結果

表3 25（OH）D3基質(zhì)效應混合實驗結果

2.3 準確度評價

由于所選DEQAS樣本25（OH）D2結果均低于本方法的定量限（2.2 ng/mL），因此在準確度結果分析時，僅采用25（OH）D的結果，即25（OH）D2與25（OH）D3之和進行分析。4% BSA基質(zhì)的校準曲線定量所得DEQAS樣本結果與靶值的相對偏移＜4%，30%乙醇水基質(zhì)的校準曲線定量所得DEQAS樣本結果與靶值的相對偏移均＞20%，其中2個結果偏移＞25%，超出可接受范圍。Passing-Bablok相關性分析結果顯示，2種基質(zhì)的曲線所得結果與靶值的相關性擬合方程分別為：Y=-0.586 6+1.033 7X，Y=0.533 4+1.235 4X。4% BSA基質(zhì)的校準曲線定量結果與靶值的一致性較好。見表4、表5、圖3。

圖3 2種基質(zhì)標準曲線所得定量結果與靶值之間的Passing-Bablok相關性分析

表4 4% BSA得出的標準曲線對DEQAS樣本的定量結果

表5 30%乙醇水得出的標準曲線對DEQAS樣本的定量結果

3 討論

本研究系統(tǒng)地探討了選擇和評價替代校準品基質(zhì)的方法，以LC-MS/MS檢測人血清25（OH）D的2種替代校準品基質(zhì)——4% BSA和30%乙醇水為例，通過比較d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3同位素內(nèi)標在2種基質(zhì)中的響應值差異、2種基質(zhì)的相對基質(zhì)效應驗證及2種基質(zhì)的標準曲線對有靶值的DEQAS樣本的定量準確度差異，全面評價了2種替代校準品基質(zhì)，并最終確定4% BSA為適用的替代校準品基質(zhì)。以4% BSA為替代校準品基質(zhì)，作為標準溶液或室內(nèi)質(zhì)量控制的配制材料，實驗室易于獲得、成本低、質(zhì)量易于控制，彌補了商品化標準溶液準確度等性能參數(shù)不穩(wěn)定、室內(nèi)質(zhì)控品濃度不合理、價格昂貴等缺點，可以滿足大規(guī)模檢測的需求。

穩(wěn)定同位素內(nèi)標在樣本預處理、色譜分離、質(zhì)譜離子化和裂解過程中，與待測物幾乎一致，因此使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標被認為是校正基質(zhì)效應最便捷的有效手段[8，14]。但有研究發(fā)現(xiàn)，待測物及其內(nèi)標在質(zhì)譜中離子抑制或離子增強的程度不一致時，待測物與內(nèi)標有不同的基質(zhì)效應。在配制標準溶液時，尤其需要注意這種情況的發(fā)生，避免選擇不合適的標準溶液基質(zhì)[12]。因此，本研究在評價替代校準品基質(zhì)時，以同位素內(nèi)標d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3在不同基質(zhì)中的響應值差異來反映25（OH）D2和25（OH）D3的響應值差異；通過基質(zhì)效應混合實驗評價待測物和內(nèi)標在不同基質(zhì)中的差異一致性，即內(nèi)標對待測物基質(zhì)效應的校正情況；并通過配制不同替代校準品基質(zhì)的溶液，對有靶值的人源基質(zhì)DEQAS樣本進行定量檢測，評價基質(zhì)差異對定量準確度的影響。

本研究在基質(zhì)效應驗證實驗中，選擇了6份不同來源的志愿者血清樣本基質(zhì)進行混合基質(zhì)效應評價，可能存在所用血清基質(zhì)不能全面反映實際檢測中患者血清樣本基質(zhì)的復雜性，無法完全地評價相對基質(zhì)效應的真實情況。因此，實驗室在自建LC-MS/MS方法、選擇替代校準品基質(zhì)時，除評價基質(zhì)效應外，檢測有靶值的DEQAS樣本是很好的選擇。本研究中，依據(jù)30%乙醇水基質(zhì)標準曲線得出的定量結果與靶值的平均偏移＞20%，而4% BSA基質(zhì)得出的標準曲線對DEQAS樣本的定量結果與靶值的差異＜4%，即不同基質(zhì)間的基質(zhì)效應，在4% BSA中可通過同位素內(nèi)標[d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3]校正，不影響檢測性能，但在30%乙醇水中不能完全校正，會影響檢測性能。

本研究還發(fā)現(xiàn)，30%乙醇水基質(zhì)中的內(nèi)標信號顯著低于血清基質(zhì)，而4% BSA基質(zhì)中的內(nèi)標響應值與血清中的內(nèi)標響應值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這可能是因為血清樣本基質(zhì)中存在蛋白等多種雜質(zhì)，僅僅通過液液萃取無法完全去除[9]，最終處理后的樣本基質(zhì)與30%乙醇水等純?nèi)軇┗|(zhì)對同位素內(nèi)標d6-25（OH）D2和d6-25（OH）D3的基質(zhì)效應，即離子增強或抑制的情況，存在顯著差異，從而產(chǎn)生了響應值的差異。因此，在本研究建立的檢測25（OH）D的LC-MS/MS方法中，替代校準品基質(zhì)4% BSA優(yōu)于純?nèi)軇┗|(zhì)30%乙醇水溶液。有文獻報道可使用純?nèi)軇8]作為替代校準品基質(zhì)，用于血清中維生素D代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS檢測，與本研究結論不一致，這可能與不同的LC-MS/MS方法對基質(zhì)效應的祛除程度不同有關，也進一步說明了不同的實驗室在建立檢測25（OH）D的LCMS/MS方法時，均有必要對所選的替代校準品基質(zhì)進行評價。

隨著LC-MS/MS技術在醫(yī)學實驗室的應用，越來越多的自建方法和商品化試劑盒被研發(fā)出來，但無論是自建方法還是商品化試劑盒，均需要解決替代校準品基質(zhì)選擇與評價的問題，以建立準確的檢測方法并實現(xiàn)準確定量。本研究提供了一種替代校準品基質(zhì)評價方案，可供實驗室自建LC-MS/MS方法或試劑生產(chǎn)者參考。