解脲脲原體感染對不育男性精液質(zhì)量的影響

王昭蓉， 張占虎， 王秋紅， 李海波， 叢 輝

（1.南通大學附屬婦幼保健院檢驗科，江蘇 南通 226001；2.南通大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇 南通 226001）

有研究結(jié)果顯示，不育男性占育齡男性的8%左右，在不孕不育夫婦中男性因素占50%[1]，其中10%～40%的男性不育與生殖道感染相關(guān)[2]。解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）可能是引起男性不育的重要原因之一[3]。UU感染后在泌尿生殖道黏膜及上皮細胞上定居，可導致精子總數(shù)、精子活力及精子正常形態(tài)率降低[4]，但其致不育的具體機制目前尚不清楚。近年來，氧化應(yīng)激對男性生殖系統(tǒng)的影響備受關(guān)注，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在精子發(fā)生、精子活力、精子獲能、頂體反應(yīng)等活動中起重要調(diào)節(jié)作用[5]。過量ROS及其代謝物可造成精子膜脂質(zhì)氧化損傷，破壞精子核內(nèi)DNA完整性，改變線粒體結(jié)構(gòu)，進而影響功能。線粒體結(jié)構(gòu)完整性、功能狀態(tài)直接關(guān)系到精子活力，而線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）是反映線粒體功能的客觀指標，可用于評估線粒體功能。本研究擬分析UU對不育男性精子常規(guī)參數(shù)、MMP、ROS的影響，探討UU感染與精液質(zhì)量的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—11月南通大學附屬婦幼保健院男性不育患者112例（不育組）。入選標準：年齡25～40歲，采集標本前1個月未使用抗菌藥物治療，無免疫性疾病，通過細菌培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)等檢驗方法排除淋病奈瑟球菌、沙眼衣原體、人型支原體、生殖支原體等常見病原體感染，無外傷、遺傳病及家族史，無明顯睪丸、附睪、輸精管等生殖系統(tǒng)器官（包含隱睪、精索靜脈曲張、睪丸扭轉(zhuǎn)等）異常。不育患者近1年夫妻生活正常，未采取避孕措施而女方未孕，女方體檢均正常，排除婦科疾病、先天遺傳因素、生殖器官畸形或病變、內(nèi)分泌因素、免疫因素等引起的不孕。對照組為臨床明確診斷是女方因素引起不孕并在南通大學附屬婦幼保健院實施體外受精聯(lián)合胚胎移植術(shù)（in vitrofertilization，IVF）的26名男性。本研究經(jīng)南通大學附屬婦幼保健院倫理委員會批準（批號：Y2017081），患者本人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 患者禁欲2～7 d，洗手消毒后通過手淫方式取精，每例患者提取2份標本，1份用于精液常規(guī)檢驗，取出標本后先觀察外觀，記錄接收時間，并靜置于37 ℃水浴箱30 min，待完全液化后開始檢測；另1份用于UU檢測。

1.2.2 儀器和試劑 WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)（computer assisted semen analysis，CASA，北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司）、BriCyte E6流式細胞儀（深圳邁瑞公司）、MagX自動核酸提取儀（上海仁度生物科技有限公司）、Bio-Rad CFX96實時熒光核酸擴增檢測儀（美國伯樂公司）、解脲脲原體核酸檢測試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）、Diff-Quik精子形態(tài)學快速染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、JC-1熒光染料和DCFH-DA熒光探針（上海碧云天生物有限公司）。

1.2.3 精液常規(guī)分析 待精液完全液化后，測定精液體積；取10 μL樣本滴加至37 ℃預溫的Makler板中，使用CASA對精液進行常規(guī)分析；0.9%氯化鈉溶液洗滌后，離心取沉淀精子滴至載玻片上，自然干燥后進行Diff-Quik染色，顯微鏡下每張玻片至少計數(shù)200個精子，計算精子正常形態(tài)率。所有操作均按《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版[6]進行。每日室內(nèi)質(zhì)控均在控，儀器狀態(tài)均正常。

1.2.4 精液UU檢測 使用MagX自動核酸提取儀提取UU RNA并擴增，擴增條件：42 ℃、1 min，40個循環(huán)。結(jié)果判定：dt≤35為陽性；dt無數(shù)值或≥40為陰性；dt結(jié)果為36～39需重復測定，如仍在36～39之間，且擴增曲線呈典型的S型，則判斷為陽性，若非典型S型曲線，則判為陰性；dt表示樣本S型曲線與閾值線交點橫坐標讀數(shù)（循環(huán)數(shù)）。

1.2.5 MMP檢測 參照試劑盒說明書，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）調(diào)整精子濃度至1×105/mL，加入JC-1染色緩沖液充分混勻，37 ℃避光孵育20 min，600×g、4 ℃離心2次，再用適量JC-1染色緩沖液重懸沉淀。檢測JC-1聚合物時，激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm；檢測JC-1單體時，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm。流式細胞儀選用前向散射光和側(cè)向散射光設(shè)門后，通過熒光通道FL1-H和FL2-H收集熒光信號。用P2/P3百分比表示膜電位高低。

1.2.6 ROS檢測 參照試劑盒說明書，用PBS調(diào)整精子濃度至1×105/mL，加入DCFH-DA熒光探針，充分混勻后37 ℃避光孵育20 min，每3～5 min顛倒混勻1次，600×g、4℃離心3次，洗去游離DCFH-DA，再用適量PBS重懸沉淀。流式細胞儀選用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光強弱，以相對熒光強度反映細胞內(nèi)ROS含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。呈非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 男性UU感染率分析

不育組中，UU感染（UU陽性組）52例，UU未感染（UU陰性組）60例，不育組UU感染率為46.4%；對照組中UU感染5例，UU未感染21例，感染率為19.2%。不育組UU感染率顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.2 UU感染對不育男性精液常規(guī)參數(shù)的影響

在不育患者中，UU陽性組精子活力、前向運動精子百分比、精子濃度、精子總數(shù)和精子正常形態(tài)率均顯著低于UU陰性組（P＜0.01），而精液量2個組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 UU感染對不育男性精液常規(guī)參數(shù)的影響 M（P25～P75）

2.3 UU感染對不育男性精液MMP的影響

UU陽性組MMP P2/P3[（0.45±0.39）%]顯著低于陰性組[（0.97±0.73）%]（P＜0.05）。見圖1。

圖1 UU陽性組與UU陰性組精子MMP檢測結(jié)果比較

2.4 UU感染對不育男性精液ROS影響

UU陽性組ROS[（48.26±8.38）%]顯著高于UU陰性組[（25.95±7.82）%]（P＜0.01）。見圖2。

圖2 UU陽性組與UU陰性組精子ROS檢測結(jié)果比較

3 討論

近年來，男性不育呈增長趨勢，男性不育患者中生殖道感染發(fā)病率較高[7]。生殖道感染可能是導致患者精液量減少、精子總數(shù)下降、精子活力降低的重要原因之一。UU是原核生物中最小、最簡單的一類無細胞壁微生物，是寄生于男、女生殖道的常見病原體，同時也是非淋性尿道炎的病原體之一。有研究結(jié)果表明，UU在男性不育生殖道中的感染率最高[8]。本研究結(jié)果顯示，不育組UU感染率為46.4%，顯著高于對照組（19.2%），其中UU陽性組精子濃度、精子總數(shù)、精子活力、前向運動精子百分比、精子正常形態(tài)率與UU陰性組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與王勇等[9]和WANG等[10]的研究結(jié)果一致。UU感染可逆行侵入生精小管，干擾精原細胞分裂，從而減少精子生成，造成精子濃度、精子總數(shù)下降。UU能吸附在精子表面，吸附部位出現(xiàn)精子膜缺損乃至嚴重損壞，使精子由流線型變得“臃腫”，尾部出現(xiàn)卷曲形態(tài)改變，有些精子因免疫反應(yīng)發(fā)生凝集，使運動阻力增大，致前向運動精子百分比降低[11]。精子正常形態(tài)率是精液常規(guī)分析中的重要指標，UU感染后精子畸形率升高，易引起男性不育[12]。有研究結(jié)果表明，精液中感染UU并不能真正影響精子質(zhì)量，只有當某種類型UU感染達到一定濃度或機體免疫力低下時，才會產(chǎn)生不良影響和相應(yīng)的臨床癥狀[13]，這也解釋了對照組也有UU感染的原因。

精子活力作為衡量精液質(zhì)量的重要指標，被視為完成精-卵結(jié)合的主要因素之一。三磷酸腺苷為精子運動提供能量，正常精子由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量傳遞電子，電子經(jīng)呼吸鏈傳遞的同時，將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)泵到內(nèi)膜側(cè)，形成MMP。JC-1是一種陽離子型親脂性熒光探針，能自由穿過細胞膜，隨細胞膜電位變化而在膜兩側(cè)保持動態(tài)平衡，其聚集程度隨MMP升高而增加。JC-1可與線粒體內(nèi)膜特異性結(jié)合，但在線粒體膜裂解時會被釋放出來，因此，用JC-1檢測MMP來判斷線粒體膜損傷程度，具有結(jié)果可靠、敏感性高等優(yōu)點[14]。本研究結(jié)果顯示，UU陽性組MMP顯著低于UU陰性組（P＜0.05），表明UU感染使精子MMP降低。董浙清等[15]的研究結(jié)果表明，MMP下降可引起精子尾部線粒體形態(tài)及位置異常、結(jié)構(gòu)紊亂、線粒體鞘缺失等。精子MMP水平還反映了精子的能量代謝水平，MMP下降表明精子運動所需能量減少，可導致精子活力下降或精子細胞凋亡、壞死。有研究結(jié)果表明，MMP與精子活率、精子活力及精子受精率呈正相關(guān)[16]。

ROS在生理狀態(tài)下一般由精子自身及精液中的白細胞產(chǎn)生，適當?shù)腞OS水平有利于維持精子細胞的正常功能。本研究結(jié)果顯示，UU感染對不育男性精子ROS有顯著影響，ROS超過一定水平后，線粒體內(nèi)膜將出現(xiàn)非特異性轉(zhuǎn)運孔道，MMP下降，因此ROS產(chǎn)生過度是MMP下降的重要原因之一。過量的ROS會導致氧化應(yīng)激，引起精子膜脂質(zhì)氧化損傷、精子DNA損傷、精子線粒體損傷及細胞凋亡，從而破壞精子功能，導致精子死亡[17]。有研究結(jié)果證實，ROS升高導致精子功能障礙是男性不育癥的一個重要原因[18]。

綜上所述，UU感染對精子質(zhì)量存在一定影響，可能機制是干擾線粒體活性等引起男性不育。積極預防和治療UU感染，對預防不育癥發(fā)生有重要意義。