血清HA、HAS2在骨腫瘤輔助診斷及療效監測中的價值

盛雨夢， 許 靜， 劉鷖雯， 何怡青， 劉 華， 黃 宜， 胡嘉捷， 崔 練， 高 鋒， 楊翠霞

（1.上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室，上海 200233；2.上海交通大學附屬第六人民醫院檢驗科，上海 200233）

原發性骨腫瘤發生于骨骼或周圍血管、神經、骨髓等附屬組織，是發病率較高的惡性腫瘤之一。初發骨腫瘤患者主要通過手術治療，但術后常會遺留微小病灶，導致腫瘤易復發。目前，臨床上主要通過影像學方法診斷骨腫瘤，尚缺乏特異性的血清學診斷指標，影響了骨腫瘤的早期診斷和預后評估[1]。透明質酸（hyaluronan，HA）是腫瘤微環境中細胞外基質的主要成分。有研究結果顯示，HA在多種腫瘤組織中明顯升高，與腫瘤的發生、發展密切相關[2]，但關于血清HA水平與骨腫瘤疾病進展關系的研究較少。透明質酸合成酶（hyaluronan synthetase，HAS）2是合成HA最主要的酶。有研究結果顯示，HAS2參與了調控腫瘤轉移過程中的上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），可促進腫瘤進展[3]。HA與HAS2無論在功能上還是在促進腫瘤發展方面均有類似的作用，骨腫瘤細胞中HA和HAS2水平均升高[4]。本研究旨在探討骨腫瘤患者手術前后血清HA、HAS2水平與骨腫瘤的關系，為骨腫瘤的臨床診斷及治療監測提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年7—9月上海交通大學附屬第六人民醫院確診的骨腫瘤患者35例（骨腫瘤組），其中男2 0例、女1 5例，年齡（40.21±21.35）歲。35例骨腫瘤患者中，骨肉瘤14例、軟骨肉瘤14例、骨纖維肉瘤4例、骨巨細胞瘤2例、尤文肉瘤1例；有19例腫瘤＜5 cm，有16例腫瘤＞5 cm；有20例存在骨質破壞，有15例無骨質破壞。所有患者均經病理檢查確診，術前均未進行過放療或化療。選取同期上海交通大學附屬第六人民醫院骨感染性炎癥患者40例（骨感染性炎癥組），其中男23例、女17例，年齡（49.15±14.91）歲。40例骨感染性炎癥患者中，骨髓炎17例、創傷后感染12例、植入物感染11例。另選取同期上海交通大學附屬第六人民醫院體檢健康者60名作為正常對照組，其中男32名、女28名，年齡（39.17±10.37）歲，血壓、血脂、血糖、肝功能、腎功能等均正常。本研究經上海交通大學附屬第六人民醫院倫理委員會批準，所有對象均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 采用分離膠促凝管采集骨感染性炎癥患者、正常對照者和骨腫瘤患者術前及術后24 h的靜脈血2 mL，離心分離血清，置于無菌Eppendorf管，保存于-80 ℃冰箱，統一檢測。

1.2.2 血清HA、HAS2水平檢測 采用MAGLUMI X8全自動化學發光免疫分析儀（深圳新產業公司）及配套試劑檢測HA。采用酶聯免疫吸附試驗檢測HAS2，試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，檢測儀器為Epoch酶標儀（美國BioTek公司）。嚴格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.2.3 血清HAS2 mRNA相對表達量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測血清HAS2 mRNA的相對表達量，檢測儀器為QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。采用血液RNA提取試劑盒（日本Takara公司）提取血清總RNA，參照逆轉錄試劑盒（日本Takara公司）說明書將mRNA逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用實時熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司）進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，65 ℃34 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt計算HAS2 mRNA的相對表達量?；蛐蛄幸姳?。

表1 HAS2與β-actin基因序列

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，治療前、后的比較采用配對t檢驗，不同組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各項指標的診斷效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨腫瘤組、骨感染性炎癥組及正常對照組血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達量的比較

骨腫瘤組術前、術后血清HA、HAS2水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），骨腫瘤組術前、術后血清HAS2水平均明顯高于骨感染性炎癥組（P＜0.05），而血清HA水平與骨感染性炎癥組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。骨腫瘤組術后血清HA、HAS2水平均低于術前（P＜0.05）。見表2。

表2 骨腫瘤組、骨感染性炎癥組及正常對照組血清HA和HAS2水平的比較

采用實時熒光定量PCR檢測了22例骨腫瘤患者、22例骨感染性炎癥患者和24名正常對照者血清HAS2 mRNA的相對表達量，結果顯示骨腫瘤患者HAS2 mRNA的相對表達量顯著高于正常對照者和骨感染性炎癥患者，腫瘤病灶切除術后HAS2 mRNA的相對表達量顯著降低。見圖1。

圖1 各組血清HAS2 mRNA表達量比較

2.2 血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達量診斷骨腫瘤的效能

建立HA、HAS2及HAS2 mRNA聯合檢測的Logistic回歸模型。ROC曲線分析結果顯示，以正常對照組為對照，Logistic回歸方程為Logit（P）=-13.618+0.204×HA+0.033×HAS2+1.014×HAS2 mRNA。HA、HAS2及HAS2 mRNA單項檢測及聯合檢測模型診斷骨腫瘤的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.888、0.651、0.747、0.956，敏感性分別為85.7%、40.0%、48.6%、85.7%，特異性分別為80.0%、91.4%、94.2%、91.4%。以骨感染性炎癥組為對照，Logistic回歸方程為Logit（P）=-3.566+0.016×HA+0.026×HAS2+0.282×HAS2 mRNA。HA、HAS2及HAS2 mRNA單項檢測及聯合檢測模型診斷骨腫瘤的AUC分別為0.485、0.782、0.630、0.789，敏感性分別為25.7%、43.4%、40.0%、80.0%，特異性分別為85.7%、96.7%、82.8%、68.5%。見表3、表4、圖2。

圖2 血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達量單項及聯合檢測診斷骨腫瘤的ROC曲線

表3 以正常對照組為對照時各項指標單項檢測及聯合檢測模型診斷骨腫瘤的效能

表4 以骨感染性炎癥組為對照時各項指標單項檢測及聯合檢測模型診斷骨腫瘤的效能

3 討論

原發性骨腫瘤約占惡性腫瘤總數的1%，該病雖然所占比例小，但是治療難度大，預后極差，易復發及轉移[5]。血清生物標志物作為監測腫瘤進展的敏感方法，在多種腫瘤早期診斷和進展監測中發揮著重要作用[6]。既往關于骨腫瘤進展的研究多集中于細胞外基質中的膠原等標志物，缺乏對其他標志物的挖掘。為了進一步探尋骨腫瘤特有的血清學標志物，本研究同時分析了骨腫瘤細胞外基質中另一種成分——HA以及HA的合成酶HAS2，以尋找更有效的血清學標志物。

HA與多種腫瘤的進展關系密切[7-8]，是腫瘤細胞外基質的主要成分，在腫瘤間質中呈高表達[9]。本研究結果顯示，骨腫瘤組和骨感染性炎癥組血清HA水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），而骨腫瘤組與骨感染性炎癥組之間差異無統計學意義（P＞0.05），這可能與炎癥患者體內的炎性因子誘導HA合成增加有關[10]。本研究結果還顯示，骨腫瘤組術后血清HA水平明顯低于術前（P＜0.05）。這提示血清HA水平具有監測骨腫瘤疾病進展的潛在價值。HA主要由HAS合成，HAS有3個異構體（HAS1、HAS2、HAS3），其中HAS2是最主要的異構體。在軟骨細胞和骨肉瘤細胞中，HAS2的表達量顯著高于HAS1和HAS3[11]。有研究結果顯示，通過抑制骨腫瘤細胞中HAS2基因的表達，可以明顯減少HA的合成[12]。本研究結果顯示，骨腫瘤組血清HAS2水平明顯高于正常對照組和骨感染性炎癥組（P＜0.05），骨腫瘤組術后血清HAS2水平低于術前（P＜0.05），與血清HA水平的變化一致。因此，HA與HAS2聯合檢測對于骨腫瘤的輔助診斷和療效監測具有更大的價值。

近年來，腫瘤細胞分泌的外泌體逐漸成為研究熱點之一。通過對外泌體中特異的mRNA進行分析，有望找到診斷腫瘤的新型分子標志物[13]。本研究對部分骨腫瘤患者血清HAS2 mRNA的表達量進行了檢測，結果顯示骨腫瘤組血清HAS2 mRNA相對表達量明顯高于正常對照組和骨感染性炎癥組（P＜0.05），骨腫瘤組術后HAS2 mRNA相對表達量低于術前，提示血清中游離的HAS2 mRNA可能與骨腫瘤的發生、發展有關，這也為下一步從分子水平上尋找骨腫瘤的特異性標志物提供了理論基礎。

本研究還對血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達量診斷骨腫瘤的價值進行了分析。ROC曲線分析結果顯示，血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達量在骨腫瘤的診斷中均有一定的價值，3項指標聯合檢測診斷骨腫瘤的效能顯著優于單項檢測。

綜上所述，HA、HAS2及HAS2 mRNA在骨腫瘤的診斷和術后監測中均有一定的價值，但本研究的樣本量較小，后續將進一步擴大樣本量，以驗證本研究得出的結論。