基于高通量測序分析孤獨癥譜系障礙兒童腸道菌群的構成變化

曾佩佩， 曾 婷， 鄧梁瓊， 郭 浩， 馮玉山， 黃麗萍， 李紅輝

（1.柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001；2.北京量化健康科技有限公司，北京 100070）

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）屬于廣泛性發育障礙中的一個類型，主要表現為社會交往障礙、言語和非言語交流障礙、刻板行為和狹隘興趣三大主要臨床癥狀[1]。近年來，ASD患病率呈現逐年上升的趨勢。BAIO等[2]的研究結果顯示，美國8歲兒童中每59人就有1人患有ASD，男女患病比例為4∶1。我國尚無大樣本流行病學報道。目前，ASD的干預方法以行為治療為主，無法達到滿意的康復效果。ASD的發病機制尚不明確，近年來隨著對腸道微生物研究的不斷深入，有學者發現腸-腦-微生態軸的紊亂可能與ASD的發生、發展有重要關系[3]。本研究擬采用高通量測序分析ASD患兒糞便樣本的腸道菌群分布，以期為ASD患兒的腸道微生態研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年2—3月柳州市婦幼保健院兒童保健科確診為ASD的患兒35例（ASD組），其中男28例、女7例，年齡（3.11±0.83）歲。選取同期柳州市婦幼保健院體檢健康兒童35名（正常對照組），其中男21名、女14名，年齡（3.37±1.24）歲。2個組之間年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經柳州市婦幼保健院倫理委員會批準，所有對象的家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

ASD患兒均符合美國精神障礙診斷和統計手冊第5版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders -fifth edition，DSM-Ⅴ）規定的ASD診斷標準。年齡2～6歲，性別不限。排除患有重大疾病者，如糖尿病、結腸炎、痢疾、肝硬化等。近1個月內未使用過抗菌藥物、激素類藥物以及注射過病毒類疫苗，未服用益生菌及益生元補充品。自愿參加本研究，且家屬簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 糞便標本采集 糞便標本采集采取立取、立存（取樣后立即保存）原則，用專用無菌糞便采集盒留取糞便，排便之前排空小便，防止樣本接觸尿液，影響檢測結果。取樣前洗手，戴無菌手套、口罩，用取便管深入糞便，采集約2 g糞便置于樣本保護液中保存。樣本采集后，標記好姓名、標號、采樣日期等以備檢查。所有對象均需完整、詳細填寫基本信息調查表，經核對準確無誤后建立完整資料數據庫。

1.3.2 樣本DNA提取、文庫構建及測序 對所有糞便樣本進行DNA提取并構建文庫。采用nova seq 6000測序儀（美國Illumina公司）及配套試劑進行測序，得到原始測序數據。所有樣本均進行生物信息數據分析，得出腸道菌群信息，并確定菌群特征。

1.3.3 生物信息數據分析 原始宏基因組測序數據采用MOCAT2軟件進行質量控制[4]。高質量的reads用SOAPdenovo v2.04軟件（參數：all-D 1-M 3-L 500）進行從頭組裝，基于組裝獲得scaftigs，用MetaGeneMark軟件進行基因結構預測[5]，預測后的基因用CD-HIT聚類算法進行聚類去冗余[6]，構建基因長度＞100 bp的非冗余基因集。采用DIAMON軟件將獲得的非冗余參考基因集與京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和碳水化合物活性酶數據庫（Carbohydrate-active enzymes database，CAZy）比對，對預測出的基因進行功能注釋。在基因層面上，將高質量的reads通過BWA軟件與構建的非冗余基因集進行對比，去除長度＜30 bp及一致性＜95%的reads，得到每個基因的reads計數，再經標準化處理獲得基因的相對豐度。在菌群上進行樣本內多樣性分析，用Shannon指數表示樣本的alpha多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。用基于bray-curtis 距離的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）在二維坐標上顯示不同樣本之間的相似性及差異性。采用相似百分比方法確定造成菌群群落差異的主要細菌種類[7]。用PERMANOVA分析[8]檢驗分組對樣本菌群差異的影響。通過Wilcoxon檢驗比較組間菌群相對豐度的差異，以確定有顯著差異的單元。采用Lefse分析尋找在各分類層級上差異顯著的單元。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序結果統計

35例ASD患兒和35名正常對照者測序后共得到408.3 G原始測序數據，樣本的reads為23 494 234～69 105 708，平均為41 748 599。測序結果進行質量控制后再進行從頭組裝、基因結構預測、聚類去冗余，最終獲得非冗余基因集。2個組之間基因的韋恩圖和box圖見圖1。韋恩圖提示ASD組與正常對照組糞便樣本中基因表達存在差異。box圖顯示2個組糞便樣本基因的集中性均較好，無明顯異常值。ASD組糞便樣本基因表達較正常對照組更集中。

圖1 ASD組與正常對照組糞便樣本中基因表達的韋恩圖和box圖

2.2 菌群組成分析

對所有研究對象的腸道菌群從物種到門水平各個層級進行分析，獲得相對豐度。結果顯示，ASD組和正常對照組的腸道菌群共包含16個門159個屬，其中糖酵母菌門2個組之間差異有統計學意義（P=0.01），但其在腸道菌群結構中相對豐度很低；厚壁菌門在所有菌群中占最主要地位，所有研究對象的優勢菌門依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門，2個組之間優勢菌門的相對豐度差異均無統計學意義（P＞0.05）。ASD組與正常對照組之間罕見小球菌屬、霍爾德曼菌屬、Candidatus Saccharibacteria noname屬、普雷沃菌屬、Burkholderiales noname屬、戈登桿菌屬、另枝菌屬、Solobacterium屬、Parasutterella屬、Anaerotruncus屬、桿菌屬、叢毛單胞菌屬、孿生球菌屬、顆粒球菌屬相對豐度差異均有統計學意義（P＜0.05），但除另枝菌屬外，其他菌屬相對豐度都很低。相對豐度居前8位的分別為擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、優桿菌屬、Blautia屬、另枝菌屬、梭菌屬及瘤胃球菌屬。ASD組與正常對照組之間僅Alistipes屬相對豐度差異有統計學意義（P=0.022）（ASD組占6.34%，正常對照組占2.44%），其他7個菌屬2個組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）,見表1。ASD組與正常對照組各菌門和菌屬的相對豐度比例見圖2。ASD組與正常對照組菌群多樣性分析的Shannon指數見圖3。基于菌群計算的樣本距離PCoA結果顯示，主坐標成分為12.5%，即樣本菌群存在差異，見圖4。造成菌群差異的主要細菌種類前20位分別為長雙歧桿菌、直腸真桿菌、Faecalibacterium prausnitzii、脆弱擬桿菌、糞普雷沃菌、普通擬桿菌、短雙歧桿菌、單形擬桿菌、Alistipes putredinis、Faecalibacterium prausnitzii、居糞擬桿菌、Ruminococcus bromii、多形擬桿菌、橢圓形擬桿菌、假小鏈雙歧桿菌、活潑瘤胃球菌、Clostridium nexile、鼠乳桿菌、Eubacterium eligens及糞擬桿菌。Permanova檢驗結果顯示分組對樣本菌群差異無影響（P=0.178），見圖5。

圖2 不同分組在菌門和菌屬水平的相對豐度組成

圖3 ASD組與正常對照組菌群多樣性的比較

圖4 基于菌群計算的樣本距離PCoA結果

圖5 Permanova檢驗結果

2.3 菌群差異分析

組間菌群相對豐度的差異分析結果顯示，ASD組翁德頓氏另枝菌、Alistipes putredinis、芬戈爾德氏擬桿菌、謝氏另枝菌、前庭鏈球菌、絲狀霍爾德曼菌、芽胞擬桿菌、伯克霍爾德菌-1-1-47、單形巨單胞菌、Gordonibacter pamelaeae、糞副擬桿菌、生黃瘤胃球菌、毛螺科菌_3_1_57FAA_CT1、Parasutterella excrementihominis的相對豐度明顯高于正常對照組（P＜0.05），而毗鄰顆粒鏈球菌、死亡梭桿菌、莫氏細小桿菌、直腸真桿菌、Candidate division_TM7_single_cell_isolate_TM7c及麻疹孿生球菌相對豐度低于正常對照組（P＜0.05），見表2。

表2 ASD組與健康對照組之間前20位菌群相對豐度差異比較

Lefse分析結果顯示，ASD組與正常對照組菌群在各分類層級上均存在有顯著差異的單元，其中ASD組糞便樣本中顯著存在的是普雷沃菌科、理研菌科、Burkholderiales noname科及叢毛單胞菌科，而正常對照組糞便樣本中顯著存在的是肉桿菌科、梭菌科、氨基酸球菌科及伯克氏菌科。見圖6。

圖6 Lefse分析結果

2.5 菌群差異功能分析

針對基于基因加和而成的KEGG和CAZy功能層面的read count豐度，分析ASD組與正常對照組的差異。ASD組與正常對照組注釋到KEGG層面及CAZy層面的基因相對豐度差異有統計學意義（P＜0.05）。差異居前20位的基因的身份識別號（identity document，ID）見表3、表4。

表3 ASD組與正常對照組注釋到KEGG層面的基因豐度差異居前20位基因的ID

表4 ASD組與正常對照組注釋到CAZy層面的基因豐度差異居前20位基因的ID

3 討論

腸道菌群是人體腸道的正常微生物，定居于腸道黏膜表面，能產生名為N-酰基酰胺的小型有機復合物，可與受體相互作用，調節人體生理健康，參與包括免疫、行為和代謝等各個方面的信號傳導[9]。腸道菌群與宿主相互影響的體系統稱為腸道微生態，是人體最大的微生態系統，該系統通過神經、內分泌免疫及代謝途徑影響中樞神經及腸道系統，這種相互作用即為腸-腦軸-微生態[10]。腸道微生物菌群對人類兒童階段的生長發育起重要作用[11]。近期有研究結果顯示，ASD的發病與腸道菌群的紊亂相關[12-13]，ASD患者的腸道菌群構成與健康人群存在差異。CORETTI等[14]采用16SrRNA測序并擴增16SrRNA（V3～V4）基因標記對2～4歲ASD患兒及同年齡健康兒童腸道菌群進行對比，結果顯示，ASD患兒擬桿菌門和變形桿菌門明顯增多，放線菌門明顯減少。STRATI等[15]通過焦磷酸測序分析發現ASD患者中厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著升高，在屬水平上，ASD組另枝菌屬、嗜膽菌屬、小桿菌屬、副擬桿菌屬和韋榮球菌屬的相對豐度下降，而柯林斯氏菌、棒狀桿菌、Dorea和乳酸菌的相對豐度明顯上升。MARíNEZ-GONZáLEZ等[16]通過回顧性分析發現，ASD患兒念珠菌、普雷沃菌、鏈球菌和細孔菌的豐度高于有便秘癥狀的兒童（P＜0.05），二者之間擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、杜氏菌門、乳酸菌門、Prausnitzii、糞桿菌門及擬桿菌門/厚壁菌門比值有明顯差異。ZHANG等[17]采用16SrRNA測序并擴增16SrRNA（V3～V4）基因標記對35例ASD患兒的腸道菌群進行研究，結果顯示，在門水平上，ASD組擬桿菌門/厚壁菌門比值顯著升高；在屬水平上，ASD組薩特菌屬、Odoribacter屬和Butyricimonas屬的基因相對豐度顯著高于正常對照組（P＜0.05），而韋榮球菌屬和鏈球菌屬的基因相對豐度顯著低于正常對照組（P＜0.05）。MA等[18]對45例ASD患兒與45名健康兒童的糞便樣本進行16SrRNA測序發現，ASD患兒腸道菌群在門水平上的微生物群相對豐度與健康兒童相比差異無統計學意義（P＞0.05），在其他層面上，ASD患兒與健康兒童相比，氨基酸球菌科相對豐度較低，Lachnoclostridium屬、Tyzzerella亞群4、Flavonifractor屬和Lachnospiraceae屬的相對豐度降低[18]。目前，ASD患者腸道菌群失調已被證實，但不同的患者微生物群改變并不一致，而且常常相互矛盾，并沒有一個獨特的微生物群組成[19]。

在菌門水平上，健康人群腸道菌群中存在厚壁菌門、變形菌門、放線菌門及擬桿菌門，這些細菌在腸道內形成一定的比例，從而控制著腸道菌群的平衡，這種關系可以直接反映宿主本身的健康狀況。本研究結果顯示，ASD患兒腸道菌群中存在4種優勢菌門——厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門及放線菌門，與正常對照者比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究結果與國外研究結果[14，16]存在差異，與國內部分研究結果[18]一致，這可能與地域差異、飲食結構差異有關。本研究結果還顯示，ASD組與正常對照組糖酵母菌門差異有統計學意義（P=0.01），但其在腸道菌群結構中的相對豐度很低。目前，對人腸道系統中糖酵母菌門的研究較少，其主要被發現存在于活性污泥中，用于處理工業污水[20]。因此，糖酵母菌門是否與ASD發病機制相關仍需進一步研究來證實。

本研究結果顯示，在菌屬水平上，ASD組與正常對照組有14種菌屬存在差異，其中相對豐度較高的另枝菌屬在文獻[15]中有過報道，其余13種菌屬相對豐度均很低，在既往的研究中鮮有報道，因此其與ASD的相關性尚需進一步深入研究。另枝菌屬屬于理研菌科，是革蘭陰性厭氧菌，為兼性致病菌。有研究結果顯示，抑郁癥患者腸道系統中另枝菌屬增多[21-22]，可能是導致抑郁癥的主要原因之一[23]。另枝菌屬可影響色氨酸的利用，破壞腸道系統中5-羥色胺的平衡，進而抑制大腦活動，這可能是導致神經系統障礙的原因之一[24]，但其與ASD的相關性仍有待進一步研究加以證實。

本研究菌群差異分析結果顯示，ASD組翁德頓氏另枝菌、Alistipes putredinis、芬戈爾德氏擬桿菌、謝氏另枝菌、前庭鏈球菌、絲狀霍爾德曼菌、芽胞擬桿菌、伯克霍爾德菌-1-1-47、單形巨單胞菌、糞副擬桿菌、生黃瘤胃球菌、毛螺科菌_3_1_57FAA_CT1及Parasutterella excrementihominis的相對豐度均高于正常對照組（P＜0.05），而毗鄰顆粒鏈球菌、死亡梭桿菌、莫氏細小桿菌、直腸真桿菌、Candidate division_TM7_single_cell_isolate_TM7c及麻疹孿生球菌相對豐度均低于正常對照組（P＜0.05）。Lefse分析結果顯示，ASD組糞便樣本中顯著存在的是普雷沃菌科、理研菌科、Burkholderiales noname科及叢毛單胞菌科，正常對照組糞便樣本中顯著存在的是肉桿菌科、梭菌科、氨基酸球菌科及伯克氏菌科。進一步利用KEGG及CAZy對差異菌群功能進行注釋，結果顯示注釋到的基因相對豐度在ASD組與正常對照組之間存在明顯差異，提示碳水化合物活性酶可能參與了ASD的發病過程。

綜上所述，ASD患兒腸道存在微生態失調，與既往研究結果[14-18]一致，但檢出的細菌種類與既往研究結果[14-18]存在差異，進一步驗證結果顯示ASD患兒并沒有一個特定的腸道微生物群組成[19]。本研究檢測出的細菌有可能是ASD發生、發展的潛在生物學標志物。但本研究尚存在一定的局限性：納入樣本量不足，研究對象年齡集中在2～6歲，且探討的是我國兒童的腸道菌群情況，與國外研究相比，研究對象的生活環境不同、飲食結構有一定的差異，因此對研究結果有一定影響。今后將擴大樣本量，進行更大范圍的研究，為ASD患兒腸道微生態研究提供更充分的依據。