miR-186通過靶向調控Smad6抑制人膠質瘤細胞增殖*

劉 艷，邵阿末，曾金艷，胡亞玲， 許 路△

(1.無錫衛生高等職業技術學校，江蘇無錫 214028；2.江蘇省無錫市人民醫院中心實驗室 214023)

膠質瘤是人顱內常見的原發惡性腫瘤，其主要特點是腫瘤細胞彌漫性浸潤生長、邊界不清、無限增殖且有高度侵襲性，治療困難，嚴重影響人類的健康。盡管膠質瘤的治療方法已取得很大的進展，但膠質瘤患者的5年生存率仍較低[1]。微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一種內源性長20～25個堿基的非編碼小分子單鏈RNA,可調控人類約1/3編碼蛋白的基因。越來越多的研究表明miRNA異常表達與多種腫瘤的發生發展密切相關，miRNA既可作為癌基因促進腫瘤生長，又可作為抑癌基因抑制腫瘤相關靶基因的表達[2]。近年來，與腫瘤相關的miRNA被陸續發現，多種miRNA參與膠質瘤發生發展。其中，miR-186在包括膠質瘤在內的多種腫瘤中低表達，功能實驗顯示其具有抑癌作用[3-5]。本研究通過生物信息學方法預測miR-186靶基因包括Smad6，并利用雙熒光素酶報告系統進行活性檢測，通過分子生物學技術證實miR-186是否通過作用于Smad6對膠質瘤細胞增殖產生影響，以期解釋兩者在腦膠質瘤發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人腦膠質瘤細胞U87購自中國科學院上海細胞所；DMEM培養液、青-鏈霉素混合液購自美國HyClone公司；LipofectamineTM2000、TRIzol等試劑購自美國Invitrogen公司；M-MLV反轉錄酶、DNA聚合酶及緩沖體系購自美國Promega公司；dNTP和相關引物購自上海生工生物工程有限公司；苯甲基磺酰胺(PMSF)、RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳配制相關產品、CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；GAPDH、Smad6抗體購自美國Cell Signaling公司；聚偏氟乙烯碳(PVDF)膜、化學發光底物ECL購自美國Millipore公司。野生型和突變型Smad6基因3′-非編碼區(3′-UTR)螢光素酶表達載體的構建和測序由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養 U87細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基進行培養，置于37 ℃、5% CO2的培養箱內常規傳代培養，定期觀察細胞密度，每2～3天換液1次。實驗所用細胞均為對數生長期細胞。

1.2.2細胞轉染及分組 制備終濃度為80 nmol/L miR-186 mimics 或80 nmol/L miR-186 inhibitor LipofectamineTM2000脂質體復合物。細胞分別加入miR-186 mimcs 或miR-186 inhibitor脂質體復合物(miR-186 mimcs 組、miR-186 inhibitor組)，同時設置對應的對照組(分別為miR-186 mimcs NC組、miR-186 inhibitor NC組)。購建Smad6過表達質粒(Smad6組)，以及對應的對照質粒(vector組),細胞分別轉染相應質粒；用Smad6過表達質?；驅φ战M質粒與miR-186 mimics或miR-186 mimics NC共轉染，再分miR-186 mimics NC+vector組、miR-186 mimics NC+Smad6組、miR-186 mimcs+vector組和miR-186 mimics+Smad6組4個組。將對數生長期的U87細胞以每孔2 ×105/mL密度接種于六孔板，待細胞融合度達70%左右時行共轉染，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中繼續培養48 h。

1.2.4定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測 收集各組細胞，用TRIzol裂解并提取各組細胞總RNA。應用紫外分光光度計測定各組細胞的總RNA濃度，然后取2 μg總RNA進行反轉錄，最后取1 μL cDNA模板于25 μL反應體系中進行RT-qPCR，其中分別以U6和GAPDH為內參。擴增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環。獨立重復實驗3次，采集數據，最后以2-ΔΔCt相對定量法計算基因的相對表達量。具體引物序列見表1。

表1 引物名稱和序列

1.2.5Western blot檢測蛋白水平 收集各組細胞，用含1% PMSF的RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白，BCA 法檢測各組蛋白濃度，每組取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離后并將其轉移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉-TBST封閉液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜， TBST洗3遍，HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗3遍，最后掃描PVDF膜并進行結果統計分析，其中以GAPDH作為內參。

1.2.6CCK-8法檢測細胞活力 將細胞按5×103密度接種于96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃條件下孵育2 h后酶標儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光度(A)值。每組設置3個復孔取平均值，另設單孔作為空白對照。細胞活力(%)=(檢測時間點A值-0 hA值)/(0 hA值-空白對照A值)×100%。

1.2.7集落形成實驗 計數細胞懸液，將細胞接種于6孔板中(每孔1×103個細胞)，置細胞于培養箱中培養3周，除去培養液，用PBS洗滌2次，加4%多聚甲醛固定細胞15 min，然后去除固定液，加適量結晶紫染色15 min，然后洗去染色液，自然環境中干燥，最后計算集落形成率。集落形成率(%)=集落形成數/接種細胞數×100%。

1.2.8雙熒光素酶報告實驗 構建野生型和突變型Smad6基因3′-UTR的報告基因質粒(wt-Smad6和mut-Smad6)，依照轉染試劑說明將miRNA-186 mimics和wt-Smad6、miRNA-186 mimics NC和wt-Smad6、miRNA-186 mimics和mut-Smad6、miRNA-186 mimics NC和mut-Smad6、miRNA-186 inhibitor和wt-Smad6、miRNA-186 inhibitor NC 和wt-Smad6、miRNA-186 inhibitor 和mut-Smad6、miRNA-186 inhibitor NC和mut-Smad6 共轉染細胞。轉染48 h后,根據試劑盒說明書建議的方法檢測上述各組細胞的相對熒光強度值。

2 結 果

2.1miR-186通過結合Smad6的3′-UTR調控Smad6的表達 通過生物信息學軟件預測miR-186與Smad6的3′-UTR區結合位點。熒光素酶報告實驗結果顯示，相比miR-186 mimcs NC組，miR-186 mimcs組降低了野生型Smad6 3′-UTR轉染細胞的熒光素酶活性(P<0.05)；而與miR-186 inhibitor NC組比較，miR-186 inhibitor組 Smad6 3′-UTR轉染細胞的熒光素酶活性增強(P<0.05)。但在轉染突變型Smad6 3′-UTR的細胞中，相比各自對照組，miR-186 mimcs組、miR-186 inhibitor組都不能改變突變型Smad6 3′-UTR細胞的熒光素酶活性(P>0.05)，見圖1。

A：生物信息學軟件預測miR-186的下游靶基因；B、C：熒光素酶報告實驗；a：P<0.05

圖1miR-186與Smad6的靶向關系

2.2miR-186負向調控U87細胞Smad6蛋白的表達水平 qRT-PCR檢測結果顯示，miR-186 mimics組miR-186的表達水平較miR-186 mimics NC組顯著升高(P<0.05)；miR-186 inhibitor組miR-186的表達水平較miR-186 inhibitor NC組明顯降低(P<0.05)，見圖2A。Western blot 實驗檢測結果顯示，與miR-186 mimics NC組比較，miR-186 mimics 組Smad6蛋白表達水平下降(P<0.05)；與miR-186 inhibitor NC組比較，miR-186 inhibitor 組Smad6蛋白表達水平升高(P<0.05)，見圖2B、C。

A：PCR分析圖；B：Western blot;C:Western blot分析圖；1:miR-186 mimcs NC組；2:miR-186 mimcs組；3:miR-186 inhibitor NC組；4:miR-186 inhibitor組；a:P<0.05

圖2miR-186對U87細胞Smad6蛋白表達水平影響

A:轉染Smad6過表達質粒后U87細胞Smad6 mRNA的表達變化；B:轉染Smad6過表達質粒后U87細胞Smad6蛋白的表達變化；C:Smad6過表達質粒或對照組質粒與miR-186 mimics NC組或miR-186 mimics共轉染后Smad6蛋白的表達變化；1：miR-186 mimics NC+verctor組；2：miR-186 mimics+vector組；3：miR-186 mimics NC+Smad6組；4：miR-186 mimics+Smad6組；a:P<0.05

圖3Smad6過表達恢復miR-186對Smad6蛋白表達的抑制作用

A:CCK-實驗；B：細胞集落形成實驗及其定量分析；1：miR-186 mimics NC+verctor組；2：miR-186 mimics+vector組；3：miR-186 mimics+Smad6組；4：miR-186 mimics NC+Smad6組；a:P<0.05,b:P<0.01

圖4miR-186靶向Smad6對U87細胞增殖的影響

2.3Smad6過表達可恢復miR-186對Smad6的抑制作用 U87細胞轉染Smad6質粒后，Smad6 mRNA和蛋白質的表達均增加(P<0.05)，見圖3。

2.4miR-186靶向Smad6抑制U87細胞增殖 CCK-8檢測結果顯示，與miR-186 mimics NC+vector組比較，miR-186 mimics+vector組U87細胞增殖能力明顯降低，miR-186 mimics NC+Smad6組細胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)；與miR-186 mimics+vector組比較，miR-186 mimics+Smad6組細胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)，見圖1A。細胞集落形成實驗顯示，與mimics NC+vector組相比，miR-186 mimics+vector組U87細胞克隆形成率明顯降低，miR-186 mimics NC+Smad6組細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)；與miR-186 mimics+vector組相比，miR-186 mimics+Smad6組細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

膠質瘤具有高發病率和低生存率的特點[6]。雖然膠質瘤的手術、放化療等治療技術已取得長足的發展，但膠質瘤患者的預后仍不理想。隨著膠質瘤分子學的研究，發現膠質瘤的本質是一種多基因異常疾病，包括抑癌基因的突變缺失及原癌基因的過表達。因此尋求新的分子基因靶點成為治療膠質瘤新的突破點。

miRNAs具有高度的保守性、組織特異性，可通過3′-UTR堿基互補的方式識別特異靶基因，在轉錄后水平降解靶基因mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而在細胞增殖、分化、凋亡中發揮重要作用。近年來的研究發現，在膠質瘤中存在大量miRNA的異常表達，并參與了膠質瘤的增殖、凋亡與侵襲等生物功能[7]。BAO等[8]研究表明miR-519a在膠質瘤標本和細胞系中多表達降低，低表達的miR-519a與膠質瘤患者較差的預后呈正相關。XUE等[9]研究發現，與正常組織相比，膠質瘤組織中miR-221/222的表達明顯升高，惡性程度高的膠質瘤組織的表達高于惡性程度低的組織，高表達miR-221/222的膠質瘤患者生存期較短。miR-186作為miRNAs中的一員，近年已成為研究的熱點,CAI等[10]研究發現miR-186在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達明顯降低，發揮抑癌作用。SU等[11]實驗結果表明與正常細胞系相比，miR-186在人皮膚惡性黑色素瘤細胞系中的表達明顯降低，過表達后可抑制腫瘤細胞增殖，同時也降低細胞的遷移和侵襲能力。另有研究表明該基因在膠質瘤中也是低表達，發揮抑癌功能，但是具體的機制并不明確[12]。本課題組前期研究也發現，與正常星形膠質細胞相比，miR-186在膠質瘤細胞中的表達明顯降低。筆者通過miRanda、miRDB、 miRWalk、 Targetscan數據庫預測出能與Smad6結合的miRNAs包含miR-186，推測miR-186可能通過靶向調節Smad6的表達來發揮作用。

Smad6是抑制性Smad蛋白，是轉化生長因子-β(transformation growth factor-β,TGF-β)信號通路的一類關鍵調控分子。TGF-β家族成員具有廣泛的細胞功能，比如調節細胞增殖與分化、細胞凋亡、細胞遷移和細胞間粘連。另外,它們在胚胎發育、免疫監督及干細胞自我更新和分化中也起著重要的作用。多個證據表明Smad6對腫瘤的發生發展發揮一定的作用。比如Smad6在胰腺癌、口腔鱗狀細胞癌中存在過表達現象,可能是導致該腫瘤發生的原因之一[13]。Smad6影響非小細胞肺癌的生存期，敲降該基因可引起肺癌細胞活力下降、凋亡增加，同時抑制細胞周期，從而重建肺癌細胞TGF-β信號通路的平衡[14]。另有研究表明Smad6在肝癌CD133+干細胞中表達增加[15]。前期研究發現Smad6在膠質瘤中表達亦增加[16]。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-186能直接結合到Smad6 3′-UTR，與生物信息學方法的預測結果一致。與文獻報道的miR-186可通過調控相關靶基因影響腫瘤的生物學功能類似[3-4],本研究也發現轉染miR-186模擬物或抑制物后，Smad6的表達水平明顯降低或升高，說明 miR-186負向調控膠質瘤U87細胞Smad6蛋白的表達水平；轉染miR-186模擬物后，細胞的增殖顯著減弱，共轉染miR-186模擬物和Smad6過表達質粒后，細胞的增殖能力有明顯恢復，故推斷在膠質瘤細胞中miR-186通過靶向調節Smad6影響了細胞的增殖能力。

綜上所述，miRNAs通過調控不同的靶基因參與膠質瘤的發生、發展過程。本文探討了miR-186、Smad6在膠質瘤發生發展中的重要作用，為膠質瘤的防治提供實驗依據，并有可能成為膠質瘤治療的新方向。