METTL23基因在豬卵母細(xì)胞、早期胚胎和主要器官中的表達(dá)

潘奕彤，申屠璐燕，吳玉婷，王恒，李明縉，黃鏡潼，孫夢娟，郭騰龍，張翔棟，張運海,，曹祖兵,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

養(yǎng)豬業(yè)一直是我國重要的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分。隨著經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，居民的膳食結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生變化，豬肉成為我國居民最主要的肉副食品。在國家政策扶持和經(jīng)濟(jì)拉動下，生豬養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，我國能繁母豬的存欄量已達(dá)到世界總量的50%。但目前國內(nèi)母豬的繁育狀況和國外相比還存在很大的差距，國內(nèi)母豬的繁殖性能還需要大幅度提升[1]。生產(chǎn)管理方面如飼養(yǎng)管理條件、營養(yǎng)條件和環(huán)境條件等，母豬自身因素如母豬窩產(chǎn)仔數(shù)少、早期胚胎發(fā)育停滯和胚胎死亡等都會影響繁殖性能。目前可以通過加強生產(chǎn)管理來避免母豬繁殖性能下降，但是很難改善母豬自身因素來增強母豬繁殖性能。因此，針對提高豬卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育能力的研究具有重要的意義。在哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中需要多種基因表達(dá)的調(diào)控，而表觀遺傳則在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用[2]。表觀遺傳有多種表現(xiàn)形式，組蛋白甲基化修飾是其中重要的調(diào)控機制之一[3-4]。在眾多調(diào)控表觀遺傳的因子中，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶起著不可缺少的調(diào)控作用。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(arginine methyltransferases，PRMTs)是甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferases，MTs)家族的一個分支，根據(jù)其理化性質(zhì)不同可分為4種類型，且所有家族成員都具有催化精氨酸甲基活性的能力[5]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在真核生物中起著非常重要的作用，包括動植物的生長、發(fā)育及適應(yīng)過程[6]。動物實驗研究表明，通過催化多種RNA結(jié)合蛋白的精氨酸甲基化，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控細(xì)胞多種重要的生命過程，如RNA代謝、細(xì)胞增殖以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。METTL23(methyltransferase-like 23)是一種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化組蛋白H3R17的不對稱二甲基化(H3R17me2a)。在小鼠實驗中，發(fā)現(xiàn)METTL23和H3R17me2a均是父源基因組重編程的關(guān)鍵調(diào)控因子，H3R17me2a不僅負(fù)責(zé)組蛋白H3.3的整合，還負(fù)責(zé)父源基因組中活躍的DNA去甲基化。METTL23通過性腺特異性表達(dá)(GSE)蛋白質(zhì)與Tet3相互作用，參與早期胚胎的表觀遺傳修飾[7-8]。

因此，本研究將利用熒光定量PCR技術(shù)測定METTL23基因在卵母細(xì)胞、早期胚胎以及心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢的相對表達(dá)量，并對相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。本研究為后續(xù)研究METTL23基因在卵母細(xì)胞、早期胚胎發(fā)育以及主要器官的生長發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

購自安徽浩翔農(nóng)牧有限公司30日齡長白豬3頭，采集心、肝、脾、肺、腎、卵巢及睪丸組織樣品。豬卵巢購自安徽省肥東福潤屠宰場，在1 h內(nèi)送至實驗室后抽取直徑3～6 mm卵泡獲取卵母細(xì)胞。

1.2 主要試劑和藥品

組織樣品RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Total RNA Kit II，OMEGA，美國)，組織樣品反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TranScript?One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，TRAN，北京)，RNA微量提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen，德國)，卵母細(xì)胞和胚胎使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QuantiTect Reverse Transcription Kit，Qiagen，德國)，熒光定量PCR試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，Vazyme，南京)。

1.3 豬各組織樣品的收集

取出-80 °C保存的組織樣品，在研缽中加入液氮進(jìn)行研磨，研磨過程中不斷加入液氮，確保液氮沒過組織樣，將組織樣粉末加入到裂解液中。本實驗共提取仔豬的心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢等7個組織樣品。

1.4 卵母細(xì)胞收集和體外培養(yǎng)

收集直徑3～6 mm卵泡中的卵母細(xì)胞，用玻璃吸管反復(fù)吹吸脫去卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體外的卵丘細(xì)胞，即GV期卵母細(xì)胞。將收集的GV期細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次后放入裂解液中，-80 ℃保存。將卵丘細(xì)胞包裹較好的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)放入體外成熟液中在38 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)42±2 h。

體外成熟液配制：TCM-199中補充100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素，10 ng·mL-1EGF，0.23 ng·mL-1褪黑素，2.03×10-5ng·mL-1LIF，2×10-5ng·mL-1IGF-1，4×10-5ng·mL-1FGF2，10 IU·mL-1eCG，5 IU·mL-1hCG，100 ng·mL-1L-半胱氨酸，5% FBS，10%豬大卵泡濾液。

1.5 孤雌激活和早期胚胎的收集培養(yǎng)

將培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞用0.1%透明質(zhì)酸酶消化1～2 min，用移液槍反復(fù)吹打脫去卵丘細(xì)胞，挑選胞質(zhì)完整、卵周隙清晰且排出第一極體的卵母細(xì)胞，即為MII期細(xì)胞，收集MII期卵母細(xì)胞樣品。然后用體外操作液(T2，TCM199+2% FBS)將挑選出的卵母細(xì)胞漂洗3～5次，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至f2液體中進(jìn)行孤雌激活(1.56 kv·cm-1，80 ms)1次，將MII期卵母細(xì)胞放在配置好的化學(xué)輔助激活劑中培養(yǎng)4 h，隨后移至胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。適時收取1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚。

1.6 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

將收集到的組織樣品，按照RNA提取試劑盒說明書提取組織樣的RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.7 卵母細(xì)胞和胚胎RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

將GV期、MII期和各時期胚胎樣品，按照RNeasy Mini Kit RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，然后按照QuantiTect Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 12 μL，gDNA Wipeout Buffer 2.0 μL，Reverse-transcription master Mix 1.0 μL，Quantiscript RT Buffer 4.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，總體積為20 μL。根據(jù)上述反應(yīng)體系充分混勻后離心30 s，放入PCR儀中42 °C孵育30 min，95 ℃加熱3 min，4 ℃循環(huán)，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)結(jié)束后放置-20 ℃保存。

1.8 引物設(shè)計和驗證

通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索豬METTL23基因，根據(jù)CDs序列(NC_010454.4)設(shè)計4對引物(表1)，訂購并獲得引物后按說明書進(jìn)行稀釋，濃度為10 μmol。按照PCR擴(kuò)增體系：cDNA 1.5 μL，2×Premix Taq 7.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，滅菌水5 μL，總體積15 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。待反應(yīng)完成后收集擴(kuò)增產(chǎn)物并配制3%瓊脂糖，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用全自動凝膠成像儀成像，分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是否符合預(yù)期，從而確定最適引物。95 ℃加熱3 min，4 ℃保存，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)結(jié)束后放置-20 ℃保存。

表1 4對引物序列信息

1.9 qRT-PCR檢測

按照qRT-PCR試劑盒說明書對卵母細(xì)胞、早期胚胎和組織器官進(jìn)行熒光定量檢測，qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.5 μL，2×Premix Taq 7.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，滅菌水5 μL，總體積15 μL。qRT-PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每個樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，且每種cDNA樣品都要有內(nèi)參基因(EF1α1)作為參考，進(jìn)而分析目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫對豬METTL23進(jìn)行分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)其包含5個外顯子，定位于12號染色體上，跨越長度4 874 bp，mRNA全長2 501 bp，CDs全長573 bp，編碼190個氨基酸。

圖1 豬METTL23基因序列結(jié)構(gòu)

從氨基酸水平比較(圖2)METTL23在不同物種之間的進(jìn)化關(guān)系，觀察發(fā)現(xiàn)，豬和人的親緣關(guān)系較為相近，說明兩者之間的親緣關(guān)系比較近。

圖2 METTL23氨基酸序列在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系

從核苷酸序列比對(表2)發(fā)現(xiàn),METTL23在豬和人之間的同源性為89.18%、豬和牛之間的同源性為90.03%；比較氨基酸序列發(fā)現(xiàn),豬和人之間的同源性為88.95%、豬和牛之間的同源性為91.19%。從核苷酸序列比對(表3)發(fā)現(xiàn)，METTL23在豬和羊之間的同源性為90.38%、豬和馬之間的同源性為90.05%；比較氨基酸序列發(fā)現(xiàn),豬和羊之間的同源性為92.23%、豬和馬之間的同源性為91.58%。從而說明METTL23在豬、人、羊之間的同源性高、保守性好。

表2 豬、人、牛METTL23基因同源性比較

表3 豬、羊、馬METTL23基因同源性比較

2.2 RNA完整性和濃度測試

觀察7種組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖(圖3)，各組織的RNA均出現(xiàn)28 s和18 s兩條條帶，且28 s條帶比18 s條帶亮，說明提取的7種組織RNA完整性較好。觀察比較7種組織的RNA濃度和各組織的D260/D280和D260/D230值的情況(表4)，7種組織的RNA完整性較好，且均未發(fā)生降解。綜合RNA的完整性、濃度值、D260/D280和D260/D230值可知本次實驗提取的7種器官的RNA均符合實驗要求，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 各器官RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表4 豬各組織中的RNA濃度

2.3 引物驗證

結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳圖(圖4)和熔解曲線(圖5)可以得知：引物METTL23-2的目的片段長度在150 bp左右，且無多余擴(kuò)增條帶，熔解曲線重合度較高，說明其特異性較好。而從熔解曲線看，引物METTL23-1和引物METTL23-4曲線重合度不好，從瓊脂糖凝膠電泳圖來看引物METTL23-3和METTL23-4有多余擴(kuò)增的條帶，有二聚體產(chǎn)生，均不適合做引物。因此，選用METTL23-2作為最終引物。

M—DNA分子標(biāo)記；1—METTL23-1 PCR產(chǎn)物；2—METTL23-2 PCR產(chǎn)物；3—METTL23-3 PCR產(chǎn)物；4—METTL23-4 PCR產(chǎn)物。

圖5 qRT-PCR熔解曲線

2.4 METTL23在仔豬各組織中的表達(dá)

METTL23在豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中均有表達(dá)(圖6)。在GV時期的表達(dá)量最高，MII期卵母細(xì)胞表達(dá)量與1-細(xì)胞時期相似，但從1-細(xì)胞時期開始表達(dá)量逐漸下降，一直到8-細(xì)胞時期達(dá)到最低，桑葚胚時期表達(dá)量開始上升并持續(xù)到囊胚期。表達(dá)量依次是GV期、MII期、1-細(xì)胞時期、囊胚期、2-細(xì)胞時期、4-細(xì)胞時期、囊胚期、8-細(xì)胞時期。

不同字母表明不同組織之間相對表達(dá)量存在顯著性差異(P≤0.05)。圖7同。

METTL23在7種組織中都有表達(dá)(圖7)。肝中的相對表達(dá)量最高，其次是腎、睪丸和心臟，脾、肺、卵巢的表達(dá)量相對較低(P≤0.05)。

圖7 不同組織METTL23相對表達(dá)量分析

3 小結(jié)與結(jié)論

本研究表明，豬METTL23包含5個外顯子，定位于12號染色體上，跨越長度4 874 bp，mRNA全長2 501 bp，CDs全長573 bp，編碼190個氨基酸。此外，METTL23在物種間保守性較高，其中豬和羊的同源性最高。通過比對豬、羊和人等5個物種的METTL23結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因所含外顯子、mRNA、CDs等并不完全一致。但是比對豬和羊這2個物種的CDs和氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，METTL23的同源性和保守性均最高，這可能是由于豬和羊的進(jìn)化速度比較一致，生物相似程度較高。

本研究主要通過qRT-PCR技術(shù)首次檢測了METTL23在豬卵母細(xì)胞、早期胚胎以及主要組織中的相對表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MELL23在GV、MII期卵母細(xì)胞表達(dá)量較高，且GV期卵母細(xì)胞表達(dá)量顯著高于MII期。研究表明，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和早期胚胎發(fā)育受特定的基因表達(dá)程序控制，組蛋白甲基化是重要的表觀遺傳修飾機制之一，參與調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂以及胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[9]。在小鼠卵母細(xì)胞中，METTL23能催化H3R17的不對稱二甲基化(H3R17me2)，且注射siRNA敲低METTL23蛋白水平后沒有降低其他精氨酸甲基化殘基的水平，研究表明，這類精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶常與基因的激活相關(guān)[10-11]。METTL23在豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中的調(diào)控機制并不明確，這對深入研究其在GV和MII期的表達(dá)水平對卵母細(xì)胞中減數(shù)分裂和某些組蛋白甲基化的調(diào)控提供新的思路。METTL23基因在1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞以及8-細(xì)胞時期的表達(dá)量逐漸降低，到8-細(xì)胞時期時表達(dá)量降至最低，這可能是因為4-細(xì)胞到8-細(xì)胞時期合子基因組激活，基因組轉(zhuǎn)錄處于活躍狀態(tài)。在小鼠中的研究表明，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在4-細(xì)胞到8-細(xì)胞時期被激活[12]。桑椹胚和囊胚時期，METTL23的表達(dá)量又逐漸升高，這可能是METTL23從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中，在外胚層細(xì)胞中表達(dá)。在小鼠實驗中，敲除PRMT5會使小鼠胚胎發(fā)育停滯在囊胚期，這表明精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在小鼠囊胚期具有重要作用。而METTL23在豬囊胚期表達(dá)量也較8-細(xì)胞時期有所提高，這對研究METTL23在囊胚期對豬多能性干細(xì)胞的調(diào)控作用研究提供思路[13]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員敲除的小鼠突變體都出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常或致死的現(xiàn)象[14-15]，表明該蛋白家族在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中至關(guān)重要。因此，深入研究METTL23基因?qū)ωi卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育的調(diào)控將是后續(xù)研究的重點。

本研究表明，METTL23在豬7種組織中均有表達(dá)，且具有顯著性差異，METTL23在肝臟中的表達(dá)量最高，其次是腎、睪丸和心臟，最后是脾、肺和卵巢。睪丸作為雄性生殖器官的重要組成部分，在生殖過程中起著精子發(fā)生的重要作用。已有研究表明，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在小鼠睪丸中高表達(dá)。在精子發(fā)育過程中，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶首先表達(dá)在精母細(xì)胞的胞質(zhì)中，而后表達(dá)在細(xì)胞核中[16]。本次實驗顯示METTL23在豬睪丸中的表達(dá)量較高，這對今后在研究METTL23基因在不同物種精子發(fā)生過程中的作用具有重大意義。卵巢作為雌性動物的生殖器官，其健康是保證正常生殖的關(guān)鍵。有研究表明，女性發(fā)生子宮內(nèi)膜位移癥后，卵巢中的多種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和CARM1蛋白顯著降低，提示精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的失調(diào)可能會導(dǎo)致卵巢良性和癌前疾病發(fā)生，如細(xì)胞增殖減弱、異常細(xì)胞克隆和基因組不穩(wěn)定等變化。而且PRMT1、PRMT2和PRMT4等多種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)會影響NOS和NO的合成，而過低的NO濃度會提高女性多囊卵巢綜合征發(fā)生的機率[13]。而本次實驗的結(jié)果表明，豬卵巢中的METTL23含量并不高，這可能是維持豬卵巢正常功能的關(guān)鍵。這對進(jìn)一步研究METTL23在豬卵巢生長發(fā)育、繁殖性能、健康等方面是如何調(diào)控的具有重要參考意義。