幾種映山紅雜交杜鵑莖段快繁體系的建立

朱春艷，盛小光，勵敏，周紹榮，陳霞，顧宏輝

(1.杭州植物園，浙江 杭州 310013；2.杭州西湖園林科學研究院，浙江 杭州 310013；3.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

杜鵑花是杜鵑花科杜鵑花屬(RhododendronL.)植物，別名映山紅、滿山紅、照山紅、山石榴、山躑躅等，是世界三大天然名花之一，也是我國傳統十大名花之一。全世界有杜鵑花900多種，產于中國的有近600種，其中400種是我國特有。杭州植物園自1956年建園以來，一直重視杜鵑花資源的收集和應用研究，其土壤屬紅壤和黃壤，pH 4.9～6.5，為杜鵑花研究提供了良好的條件[1]。

20世紀90年代初，杭州植物園把篩選出的杜鵑花種、品種和自選育雜交組合的3 000多株杜鵑栽植于玉泉景點西南面，以杜鵑花為主的各種植物配置，建設了占地約3 hm2的杜鵑花專類園。其中雪粉和雪翠2個新品種于2016年獲得植物新品種授權。杭州植物園廣泛開展了杜鵑屬的種內雜交和種間雜交，雜交組合超過300個，為開展杜鵑花育種研究積累了一定的基礎和豐富的經驗，尤以映山紅(杜鵑花屬的一種)為親本的杜鵑花育種取得成效。杭州植物園選擇我國分布最廣、抗性最強且在我園引種馴化成功的野生映山紅做母本，以貴妃醉酒、紅霞、玉玲、月白風清等色彩鮮艷、觀賞價值高的杜鵑為父本，所配的組合不僅表現明顯的親合性，而且每個組合的雜交F1具有明顯雜種優勢，體現在花色、花大小、花期、株型以及抗性等方面。近年來新育成了映玉1號、映玉2號、玉映、映紫等映山紅類雜交杜鵑。隨著對新育成杜鵑品種的大規模生產需求，品種規模化生產成為產業化的關鍵技術。

目前，杜鵑花的繁殖方式主要采用播種、扦插和嫁接等[2]，存在季節、環境的制約性大、繁殖系數低、成活率低等問題，難以進行大規模推廣生產。應用組織培養技術進行杜鵑繁殖，具有繁殖速度快、系數高、季節影響低等特點，對于珍貴優良杜鵑品種的引進和規模化生產具有重要意義。

本文在前期組培快繁技術的基礎上[2-3]，對新育成的映山紅進行組培快繁技術研究，成功利用新發枝條的莖段外植體誘導出了叢生芽，并且實現了瓶苗的正常生根，為新品種組培快繁生產技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為杭州植物園育成的映山紅雜交杜鵑，編號1、2、3和4，分別為映玉1號、映玉2號、玉映和映紫。

1.2 外植體滅菌

在春季4—5月，摘取母株中的新發嫩枝為外植體。剪去葉柄基部，去除所有葉片，將外植體剪成2～3 cm長的莖段備用。在自來水中沖洗約1 h，再用70%的酒精浸泡10 s，隨后在0.1% HgCl2溶液中振蕩滅菌12～15 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3～4次，用滅菌濾紙吸干備用。

1.3 叢生芽誘導

將滅好菌的備用枝條切除莖尖，余下的枝條剪成約1 cm長的莖段，每段帶有1～2個腋芽節，接種到WPM叢生芽誘導培養基上[2-3](添加不同濃度的反-玉米素，30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂，pH約4.3)。于25～28 ℃光培養(16 h)25～35 d，莖段腋芽長至2～3 cm后，切取新發腋芽并切除莖尖，移入上述WPM誘導培養基上進行增殖培養，相同的溫度和光照條件下培養30～40 d后，腋芽基部生長出叢生芽(圖1)。

圖1 映山紅1號(試驗編號R60)叢生芽誘導

1.4 瓶苗根的誘導

從誘導出的叢生芽中切取生長粗壯的枝條，接種于添加不同濃度的吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)的WPM基本培養基上，于25～28 ℃(16 h)，光培養約25 d，誘導生根。

2 結果與分析

2.1 外植體腋芽誘導分化情況

供試的4個杜鵑品種均能被成功誘導，平均誘導率為45.3%～61.5%。滅菌好的外植體，約有30%在接種后1周內發生污染，另有約10%會在接種后2～4周內發生污染，另有5%～10%的外植體雖然沒有發生污染，但可能因為滅菌過程中受到傷害而沒有萌發。

外植體中的腋芽能在添加0.5～3.0 mg·L-1trans-ZT的WPM培養基中被誘導萌發，腋芽的萌發速度會隨著trans-ZT的濃度的增加而加快。接種約14 d后，腋芽處開始膨大萌動。約30 d后，形成帶有2～3張葉片的小枝條。約60 d后，形成帶有6～8張葉片，長度達2～4 cm的小枝條。將新誘發的無菌枝條切成帶有1～2個腋芽的莖段，移入增殖培養基進行叢生芽誘導培養，約50 d后在每一腋芽處誘導出數個新的枝條(表1)。

表1 4種映山紅雜交杜鵑側芽誘導和增殖情況

2.2 培養基對叢生芽誘導的影響

2.2.1 不同類型的WPM培養基對枝條增值誘導的影響

以往研究結果表明[2-3]，WPM基本培養基是杜鵑枝條增殖較為適宜的培養基，本研究選用了兩種類型的WPM培養基，基本成分一樣，但配制形式不同。一是配制大量、微量、有機和鐵鹽等物質的母液，量取不同體積的母液配制成WPM工作液(WPM-1)。二是購得末狀固體，取2.47 g粉末即可配制1 L的WPM工作液(WPM-2和WPM-3)。總體而言，兩種類型的WPM培養基對杜鵑枝條增殖的效果差異不顯著，但也存在細節上的區別，如WPM-2和WPM-3培養基上杜鵑枝條增殖系數略低于WPM-1培養基，但是其誘發的枝條相比更為粗壯(表2)。

表2 不同培養基對杜鵑枝條增殖的影響

2.2.2 叢生芽激素濃度對枝條增殖的影響

含有不同濃度的trans-ZT的WPM培養基，對杜鵑枝條的繁殖系數及生長情況產生顯著影響。總體而言，隨著trans-ZT濃度的增加，枝條的繁殖系數提高。但相對較低濃度的trans-ZT使得枝條的生長速度變慢，誘發的新枝條相對粗壯；而相對高濃度的trans-ZT使得新枝條的生長速度過快(表3)，枝條變細，可利用率下降，所以需綜合增值系數和生長情況選擇適合的trans-ZT的濃度。此外，不同品種對trans-ZT濃度變化的響應略有不同，其中品種1和2的適宜trans-ZT濃度(2.0 mg·L-1)略高于品種3和4(1.5 mg·L-1)。

表3 不同濃度的trans-ZT對杜鵑枝條增殖系數的影響

2.2.3 生根激素濃度對瓶苗根誘導的影響

研究了3種生根激素及不同濃度對瓶苗生根誘導的影響。結果表明，IBA和NAA誘導生根率都達到了95%以上，而IAA的誘導生根率較低，為40%左右。此外，IBA誘導的根系要比NAA誘導生長的根系更為粗壯(圖2)。IBA和NAA的適宜濃度分別為100～150 μg·L-1和50～100 μg·L-1，使瓶苗的生根誘導率達到90%以上。當試驗低于此濃度時，根誘導效果較差，當高于此濃度時會使氣生根的數量增加，同時也導致枝條的生長受到抑制。

圖2 添加100 μg·L-1的不同激素對杜鵑瓶苗生根誘導的影響

3 討論

本研究以本單位培育的4個映山紅杜鵑雜交種的莖段為外植體，在添加不同濃度的trans-ZT的WPM培養基上成功誘導出無菌的幼嫩新枝條；通過進一步的增殖培養，獲得了較高繁殖系數并生長粗壯的叢生枝條；最后通過生根誘導，成功獲得了大量組培苗。本試驗結果為映山紅雜交杜鵑外植體組培和無菌擴繁的技術和規模化生產提供技術支撐。

WPM基本培養基是以往研究報道的最適合杜鵑莖段組織培養和無菌擴繁的培養基。現在市場上有合成的WPM固體培養基銷售，此類培養基已經添加各種WPM培養基的基本成分，可依據試驗要求的用量(如本試驗2.47 g·L-1)進行工作液的配制，比傳統的母液配置更為簡單、快捷。本試驗分別采用了國產與進口的WPM固體培養基，整體培養效果與傳統的母液配置法相當，甚至在枝條的生長發育方面更顯優勢，可作為商業化生產使用。

玉米素是一種天然的細胞分裂素，可以有效刺激細胞分化及側芽的生長。玉米素在結構上有順、反兩種異構體，反式異構體具有更強的生物活性。本試驗結果表明，反-玉米素可以有效誘導杜鵑莖段枝條增殖，這與前人的研究結果相符。試驗表明，該激素添加的濃度不宜過高，過高會產生畸形腋芽或者玻璃化苗。本試驗4個杜鵑品種的最適trans-ZT濃度為1.5～2.0 mg·L-1，其增殖系數可以達到4.1～7.2倍，取得了比較好的繁殖系數和再生苗的質量。

杜鵑是生長比較緩慢的木本植物，其組培苗的生根誘導一直是個難題。本試驗選用的3種不定根誘導激素中，IBA和NAA的誘導效果要明顯優于IAA。其中100～150 μg·L-1的IBA或50～100 μg·L-1的NAA都可以使組培苗的生根率達到90%以上，而且根系較為發達，移栽成活率高。