酸棗仁皂苷B通過調節自噬抑制血小板衍生生長因子-BB誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移

嵇再雄， 李家祺， 王建波

血管介入術是治療危重肢體缺血的有效方法，但其遠期成功仍受到術后高發再狹窄影響［1］。糖尿病引起的下肢動脈病變管徑小且時間長，術后遠期效果更加不理想［2］。藥物洗脫支架可防止再狹窄［3］，但術后血管愈合延遲和晚期血栓形成風險增加使之并不能成為再狹窄長遠解決方案［4-5］。介入操作無可避免地損傷動脈內膜，內膜撕裂可導致膠原暴露和持續性炎癥。血管損傷血小板、炎性細胞和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）釋放血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF），刺激其發生去分化。PDGF可與PDGF受體（PDGFR）α或β結合，激活PI3K/Akt、MAPK等多條 信 號 轉 導 通 路，導 致VSMC增 殖 和 遷 移［6］，而VSMC過度增殖和遷移是血管介入術后再狹窄的主要原因。目前針對血管新內膜增生和再狹窄的臨床藥理學干預仍不令人滿意，尋找更有效藥物防治再狹窄及闡明其潛在機制仍具挑戰。酸棗仁是亞洲國家著名傳統藥物，具有催眠鎮定、抗焦慮、抗氧化應激等功能［7-8］。酸棗仁皂苷B（jujuboside B，JuB）作為天然皂苷三萜類化合物，是酸棗仁中主要生物活性成分之一［9］。研究表明JuB具有抗血小板聚集［10］、誘導 腫 瘤 細 胞 自 噬 和 凋 亡［11］、降 低 血 管 張 力［12］、抗 炎癥［13］等作用，然而JuB對血管介入術后VSMC增殖和遷移的潛在影響仍未知。本研究旨在對JuB在VSMC生理調節中的作用及其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品和試劑

JuB（高效液相色譜法檢測純度≥98%，化學結構C52H84O21，分子量1045.223，上海貝吉斯生物科技中心）；高糖Dulbecco改良伊格爾培養基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、乙二胺四乙酸（EDTA）-胰蛋白酶（美國Gibco公司）；重組人PDGF-BB（美國R&D公司）；細胞計數試劑盒（CCK）-8（上海翊圣生物科技公司）。

1.2 細胞培養和實驗分組

將大鼠胸大動脈VSMC——A7r5（中國科學院生物化學與細胞生物學研究所）置于含10%FBS的DMEM并于37℃、5%CO2濕潤條件下培養。取3～5代細胞用于實驗。25 ng/mL PDGF-BB刺激A7r5建立損傷模型。實驗分為5組：正常對照（NC）組、PDGF-BB組、JuB（10μmol/L）＋PDGF-BB組、JuB（25μmol/L）＋PDGF-BB組、JuB（50μmol/L）＋PDGFBB組。

1.3 CCK-8測定

將5×103個A7r5種入96孔板每孔中，并在37℃下培養過夜以貼壁。細胞達到70%時，吸出培養基，用PDGF-BB（25 ng/mL）和JuB（0、1、10、25、50、100μmol/L）分別處理細胞；向每孔中補充CCK-8溶液10μL，將樣品于37°C下孵育2 h；用SpectraMax i3x型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）于450 nm下測試細胞光密度（OD）；基于對照的百分比計算細胞活性（%）。每組設置5個重復孔。

1.4 劃痕愈傷實驗

將A7r5接種在12孔板中，培養至80%密度，置于含PDGF-BB（25 ng/mL）或JuB（50μmol/L）培養基中培養24 h；用20μL移液管尖在平板上劃出一道筆直劃痕，24 h后用倒置顯微鏡（×50，德國Leica公司）拍攝傷口，采用ImageJ 1.53a版圖像處理軟件（美國國立衛生研究院）并根據恢復面積百分比分析細胞遷移程度。遷移指數＝實驗組遷移距離/對照組遷移距離。

1.5 免疫印跡檢測

將A7r5接種在6孔板中，細胞達到70%～80%時用PDGF-BB和/或JuB處理各組細胞；用裂解緩沖液（上海碧云天生物技術公司）從細胞中提取蛋白質樣品，提取液于4℃、12 000轉離心20 min，取上清液，用二辛可酸（BCA）蛋白質分析試劑盒（上海碧云天生物技術公司）評估蛋白質樣品濃度；按照標準規程處理獲得等體積等量蛋白質樣品；經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）膠（10%分離膠）電泳后，樣品中蛋白條帶被分離，行聚偏二氟乙烯（PVDF）（美國Millipore公司）轉膜；5%脫脂牛奶封閉膜上非特異性結合位點1 h，膜與一抗在搖床上4℃孵育12 h，所用一抗為小鼠抗增殖細胞核抗原（PCNA）單抗（美國CST公司，1∶1 200稀釋）、兔抗LC3B單抗（英國Abcam公司，1∶1 200稀釋）；將膜與二抗在搖床上室溫孵育1 h，所用二抗為抗兔二抗（上海碧云天生物技術公司，1∶1 500稀釋）、抗小鼠二抗（上海冠泰生物科技公司，1∶40 000稀釋）；洗膜5次后，用超敏顯影液（南京諾唯贊生物科技公司）和化學發光成像系統曝光可視化所得目的條帶，根據條帶灰度值用ImageJ 1.53a版軟件作半定量分析。β-微管蛋白（tubulin）作為內參。

1.6 統計學分析

實驗數據獲得至少通過3次獨立重復實驗。采用GraphPad Prism 8.0軟件進行單因素方差分析，數據以均數±標準差（±s）表示，P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 JuB抑制PDGF-BB誘導的A7r5增殖

各濃度（0～100μmol/L）JuB預處理A7r5 24 h，再用PDGF-BB（25 ng/mL）刺激24 h，結果顯示JuB呈濃度依賴性顯著抑制PDGF-BB誘導的A7r5增殖；與正常對照組相比，25 ng/mL PDGF-BB處理后A7r5增殖能力顯著增加，而5～100μmol/L JuB預處理顯著降低PDGF-BB誘導的A7r5增殖能力，見圖1。由于JuB在100μmol/L作用濃度時細胞活力低于正常對照組，后續選用10、25、50μmol/L JuB進行多劑量實驗。免疫印跡法檢測增殖標記物PCNA蛋白顯示，PDGF-BB（25 ng/mL）顯著誘導PCNA表達（P＜0.001）；與PDGF-BB組相比，JuB預處理呈濃度依賴性顯著降低PCNA表達，見圖2。

圖1 不同濃度JuB對A7r5活力的影響

2.2 JuB減弱PDGF-BB誘導的A7r5細胞遷移

劃痕愈傷實驗結果顯示，與正常對照組相比，PDGF-BB刺激24 h顯著縮小劃痕開口（P＜0.001）；相比于PDGF-BB刺激組，10、25、50μmol/L JuB預處理可呈劑量依賴性顯著抑制PDGF-BB誘導的A7r5細胞遷移，見圖3。

圖2 各組A7r5 PCNA相對表達量

圖3 24 h時各組A7r5細胞遷移情況（倒置顯微鏡，×50）

2.3 JuB逆轉PDGF-BB誘導的A7r5細胞自噬

免疫印跡法檢測自噬的分子標記物微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3）B蛋白，結果顯示A7r5細胞LC3B蛋白表達在PDGF-BB組顯著高于正常對照組（P＜0.001），提示PDGF-BB激活A7r5細胞自噬；PDGF-BB+JuB組顯著低于PDGF-BB組，表明JuB可抑制PDGF-BB誘導的A7r5細胞自噬，見圖4。

3 討論

新內膜增生是血管介入術后再狹窄的關鍵進程［14］。VSMC過度增殖和遷移在新內膜增生發生發展中起著關鍵作用，因此抑制VSMC異常增殖和遷移對預防再狹窄具有重要意義。PDGF-BB是從受損血管釋放出的最有效促分裂原之一，在促進VSMC增殖中起重要作用［6］。本研究選擇PDGF-BB作為體外刺激劑建立細胞模型并用JuB進行干預，觀察JuB對VSMC增殖和遷移能力的影響。

圖4 各組A7r5細胞LC3B蛋白相對表達量

有研究表明JuB具有抗腫瘤作用，然而其是否可抑制PDGF-BB誘導的VSMC增殖和遷移尚未見報道。本研究通過CCK-8檢測A7r5細胞活性間接反應細胞增殖情況，免疫印跡實驗檢測到增殖標記物PCNA被JuB下調，并用劃痕愈傷實驗檢測JuB對VSMC遷移調節作用，首次發現JuB可能是一種能有效阻止PDGF-BB誘導的VSMC增殖和遷移的藥物。

為進一步探究JuB對VSMC增殖和遷移的抑制機制，本研究檢測自噬標記物LC3蛋白表達水平。細胞處于能量匱乏、應激狀態時，可通過上調自噬分解更多蛋白質，從而提供細胞存活需要的能 量［15］。已有文獻 報 道，PDGF-BB可誘 導 自 噬［16］。自噬激活可促進細胞增殖、遷移［17］。本研究通過免疫印跡檢測顯示，JuB可顯著抑制PDGF刺激的A7r5細胞LC3B蛋白表達，因此JuB可能通過抑制自噬發揮對VSMC增殖和遷移的抑制作用。

綜上所述，本研究結果顯示JuB可抑制VSMC異常增殖和遷移，機制上可能與其抑制PDGF-BB誘導的VSMC自噬有關，提示對血管介入術后新內膜增生引起的再狹窄具有治療作用。更為具體的生物學機制有待進一步深入研究。