RNF144A基因在皮膚惡性黑色素瘤中的表達及臨床意義*

王智浩，曹如柔，蔣 帆，劉 韻，蔣益蘭

(1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院腫瘤科，湖南 長沙 410006)

皮膚惡性黑色素瘤(SKCM)是惡性程度很高、侵襲能力很強，發生在皮膚中的惡性腫瘤，占所有皮膚惡性腫瘤的5%，是死亡率最高的皮膚癌類型[1]。雖然轉移性黑色素瘤新療法廣泛應用使SKCM的死亡率有所下降，但SKCM的發病率依舊在持續增加[2-3]。RNF144A基因是泛素化蛋白編碼基因家族中的重要成員，參與蛋白質定位、轉運、修飾及蛋白質間的相互作用[4-6]。泛素化過程涉及細胞周期調控、染色體有絲分裂、核酸損傷修復[7-9]。有研究發現，RNF144A基因在帕金森病[10]、肺纖維化[11]、心力衰竭[12]、乳腺癌[13]等疾病中作用顯著。本研究采用數據挖掘的方法，分析RNF144A在SKCM中的作用及對其預后的影響，為SKCM的精準診斷及治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1RNF144A 基因在不同腫瘤組織中表達差異性分析 GEPIA是基于TCGA和GTEx數據庫中的腫瘤和正常樣本進行基因表達分析的網站[14]。通過GEPIA數據庫 (http://gepia2.cancer-pku.cn)分析不同腫瘤間RNF144A基因的差異性表達。進入網站后選擇single gene analysis，輸入RNF144A，在GeneralInformation中查看分析結果。

1.2RNF144A 基因在SKCM中表達差異性分析 Oncomine數據庫是癌癥微陣列數據庫和基于Web的數據挖掘平臺，可以通過此數據庫對腫瘤臨床和病理學進行探索，采用t檢驗的方法進行差異分析[15]。通過Oncomine數據庫(http://www.oncomine.org)分析SKCM組織與癌旁組織中mRNA差異性表達。檢索條件：(1)Analysis type:Melanomavs.Normal analysis；(2) Cancer type:Cutaneous melanoma；(3) Data type:mRNA；(4)Concept type:Over-expression (Oncomine concepts)。

1.3RNF144A基因在SKCM中表達的亞組分析 UALCAN數據庫是使用癌癥基因組圖譜(TCGA) 3級RNA-seq和來自31種癌癥類型的臨床數據對基因、臨床表型及疾病進行深入分析的交互式網絡門戶[16]。通過UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)對RNF144A基因在SKCM中的表達進行樣本類型、腫瘤分期、年齡、體重、性別、種族的亞組分析，以箱線圖展示。進入網站后，在TCGAanalysis界面輸入RNF144A，TCGA dataset選擇SKCM，然后在Links for analysis欄選擇Expression。

1.4基于OncoLnc網站進行生存分析 OncoLnc網站包含了TCGA進行的21項癌癥研究中8 647例患者的生存數據，用戶能夠通過基因表達區分患者并進行Kaplan-Meier生存分析[17]。通過OncoLnc網站(http://www.Oncolnc.org)繪制RNF144A基因表達與SKCM患者生存周期相關曲線。進入網站后輸入RNF144A，選擇SKCM，在Kaplan plot for RNF144A in SKCM的界面中，LowerPercentile和Upperpercentile分別輸入50、50。

1.5SKCM中RNF144A基因的共表達基因 通過UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu)查找SKCM中RNF144A基因的共表達基因。進入網站后，在TCGAanalysis界面輸入RNF144A，TCGA dataset選擇SKCM，然后在Links for analysis欄選擇Correlation。

1.6String 蛋白網絡分析 String蛋白網絡分析可預測蛋白質與蛋白質相互調控網絡[18]。通過String數據庫(https://string-db.org/)預測RNF144A蛋白的上下游調控蛋白及蛋白間的相關調控關系。檢索條件：(1) Portein name：RNF44A；(2) Organism：auto-detect。

2 結 果

2.1RNF144A 基因在不同腫瘤類型中的差異性表達 通過GEPIA數據庫分析發現，RNF144A在急性髓系白血病(LAML)、SKCM、胃腺癌(STAD)、胸腺瘤(THYM)中高表達，在宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、子宮內膜癌(UCUC)、子宮內膜肉瘤(UCS)中低表達。見圖1。

2.2RNF144A基因在SKCM中表達差異性分析 通過Oncomine數據庫分析SKCM中RNF144A基因轉錄水平，共有2個數據源，分別來自RIKER等[19]和TALAN TOV等[20]研究，共計137個樣本(圖2)。對這些數據進行差異性分析發現，RNF144A轉錄的mRNA在SKCM中高表達，與其在正常組織中的表達比較，差異有統計學意義(P=0.001)。

圖1 GEPIA數據庫中RNF144A在不同腫瘤中差異性表達

圖2 Oncomine數據庫中在SKCM中基因差異性表達

2.3RNF144A基因在SKCM中基因表達的亞組分析通過UALCAN網站對RNF144A基因在SKCM中表達進行樣本類型、腫瘤分期、年齡、體重、性別、種族的亞組分析,發現RNF144A在男性SKCM患者中的表達明顯高于RNF144A在女性SKCM患者中的表達存在顯著差異(P=0.003)(圖3C),在其余亞組分析即不同樣本類型的SKCM中、不同腫瘤分期的SKCM中、不同種族的SKCM中、不同年齡的SKCM中、不同體重的SKCM中RNF144A的表達差異無統計學意義(圖3A、3B、3D、3E、3F)。

2.4基于OncoLnc網站的生存曲線 通過OncoLnc網站繪制RNF144A基因表達與SKCM患者生存周期相關曲線，RNF144A高表達組與低表達組樣本各有229例，繪制生存曲線發現(圖4)，RNF144A高表達組患者生存周期較低表達組明顯降低，差異有統計學意義(P=0.00 165)。

2.5SKCM中 RNF144A基因的共表達基因 通過UALCAN數據庫查找發現Pearson-CC大于0.5的基因有602個，按Pearson-CC降序排列，選取前25個基因，繪制RNF144A基因在SKCM中共表達基因的熱圖(圖5)，這些基因分別是PRKCE、C2orf29、HMG20A、USP39、SLC35E3、KCMF1、POLR1A、MSI2、RNF115、PTCD3、LRPPRC、C2orf44、PNO1、UBXN2A、POLR2D、MARS2、E2F6、PPP3R1、C2orf43、FAM168B、CTBP2、ADSS、GPN1、IMMT。

A.不同樣本類型的SKCM中RNF144A的表達;B.不同腫瘤分期的SKCM中RNF144A的表達;C.不同性別的SKCM中RNF144A的表達;D.不同種族的SKCM中RNF144A的表達;E.不同年齡的SKCM中RNF144A的表達;F.不同體重的SKCM中RNF144A的表達;與男性患者比較，aP<0.05。

圖4 RNF144A基因不同表達水平的SKCM患者總體生存曲線

圖5 SKCM中RNF144A基因的共表達基因熱圖

2.6RNF144A基因上下游關系預測 在String網站中，分析RNF144A基因上下游關系，得到相應的關系網絡圖(圖6)，PPI富集P值(PPI enrichmentP-value)=0.031 3。相互作用節點數共有11個，分別為PRKDC、UBC、RPS27A、UBB、UBA52、UBE2L3、CMPK2、TSSC1、MRPL37、RNFT2。RNF144A基因主要參與蛋白質代謝和蛋白質泛素化。E3泛素蛋白連接酶以硫酯的形式從E2泛素結合酶UBE2L3和UBE2L6接受泛素，然后將泛素直接轉移至目標底物。

圖6 RNF144A與上下游基因調控關系

3 討 論

SKCM是惡性程度最高的惡性腫瘤之一[21]。目前，針對SKCM的靶向治療及免疫療法取得了突破性進展，并在早期診斷和預防方面獲得了不可忽視的進步，但SKCM的預后依舊不容樂觀，尤其遠處轉移的患者，3年生存率不足20%[22-23]。

RNF144A基因是蛋白質泛素化家族基因中的重要成員。泛素化是蛋白質的翻譯后修飾，可與細胞質DNA-PKcs相互作用并降解，維持EGFR信號傳導，在DNA損傷過程中促進細胞凋亡,在細胞內穩態中發揮核心作用[24-25]。有證據表明，靶向泛素化在惡性腫瘤的治療及預后中存在巨大潛力[26-27]，但RNF144A基因與SKCM的相關性研究尚缺乏相關報道。

本文通過GEPIA網站和Oncomine數據庫分析發現RNF144A基因在SKCM中高表達，基于此結論，RNF144A基因有可能成為一個SKCM分子診斷的新的生物學標記物?；赨ALCAN數據庫對RNF144A基因在SKCM中表達進行樣本類型、腫瘤分期、年齡、體重、性別、種族的亞組分析，發現男性患者的RNF144A基因表達高于女性患者?；贠ncoLnc網站的生存分析發現RNF144A基因高表達組患者生存周期明顯短于低表達組，提示RNF144A基因的表達與SKCM的預后顯著相關，證明了RNF144A基因可作為SKCM治療的潛在靶點?；赨ALCAN數據庫的共表達基因發現RNF144A基因在SKCM中存在眾多的共表達基因，為進一步的分子機制研究開拓了新的思路。通過String蛋白網絡分析發現，RNF144A可能與PRKDC、UBC、RPS27A、UBB、UBA52、UBE2L3、CMPK2、TSSC1、MRPL37、RNFT2等蛋白相互作用，這為RNF144A基因表達調控研究提供了方向。

本研究使用不同數據庫及在線分析工具分析了RNF144A與SKCM之間的相關性，發現RNF144A在SKCM中高表達，參與腫瘤發生、發展的調控，為進一步實驗驗證提供了理論依據，同時為SKCM精準診斷及治療提供了新的思路。