除硫菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)條件研究與應(yīng)用

楊 帆，孟章進(jìn)，姜桂英，錢志鴻，王志明

(1.中國石化江蘇油田分公司工程技術(shù)研究院，江蘇 揚(yáng)州，225009；2:江蘇省油氣微生物工程研究中心，江蘇 揚(yáng)州，225009)

微生物人工培養(yǎng)和自然條件下的生理特性有很大的不同，影響合成代謝產(chǎn)物能力的因素也有相當(dāng)大的差異，其中培養(yǎng)基對(duì)微生物的各種代謝活動(dòng)的影響最為顯著［1-2］，培養(yǎng)基的成分對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離及產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要影響，除此之外，溫度、pH 值、裝液量等操作條件也是影響微生物生長(zhǎng)的因素［3-4］。因此，微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化非常重要。N411 是一株高溫除硫菌，為提高該菌的培養(yǎng)效能，提高發(fā)酵水平，從溫度、pH 值、搖瓶裝液量3 個(gè)因素著手，開展了工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件研究。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

按照表1 的組成成分設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基，比較不同配方條件下N411菌株的生長(zhǎng)增殖情況，以確定合適發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基。

表1 發(fā)酵配方設(shè)計(jì) g

1.2 檢測(cè)方法

比濁法:取一定量搖瓶液，稀釋不同倍數(shù)后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm 的吸收值（OD600）。

平板菌落計(jì)數(shù)法:取搖瓶液1 mL，分別稀釋至10～5、10～6、10～8倍（由預(yù)試驗(yàn)得出），取0.1 mL的稀釋菌液涂布于固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)1 d 后，計(jì)算搖瓶液中的活菌數(shù)。

細(xì)菌數(shù)（CFU/mL）=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)／平板上加菌液的量（mL）。

pH 檢測(cè):定期取樣，以4.0～9.0 精密pH 試紙檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 除硫菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源篩選

以XSN 為基本氮源，保持質(zhì)量濃度10 g/L 和其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分配比不變，分別設(shè)置2 g/L PTT、3 g/L YMF、1 g/L PTT +1.5 g/L YMF 作為不同碳源處理，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基最終pH 為7.0，50℃培養(yǎng)并觀察菌體生長(zhǎng)情況，明確不同碳源條件下除硫菌N411 的增殖影響。

以YMF 作為多糖部分或全部替代PTT 測(cè)定除硫菌N411 對(duì)多糖的分解利用能力（圖1）。試驗(yàn)結(jié)果表明，2 g/L PTT 作為碳源培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)較好，50℃培養(yǎng)16 h后菌體達(dá)最大濃度，1 g/L PTT+3 g/L YMF 的細(xì)菌繁殖量明顯低于20 g/L PTT 處理。以5 g/L YMF 替代PTT 的培養(yǎng)基中除硫菌N411繁殖速度慢，12 h 達(dá)最大高峰期，表明除硫菌N411 能有效利用PTT等單糖作為碳源，而對(duì)DF為碳源的多糖降解利用能力較弱，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菌體增殖能力與培養(yǎng)基PTT濃度成正相關(guān)。

圖1 不同碳源培養(yǎng)基對(duì)除硫菌N411發(fā)酵培養(yǎng)的影響

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源篩選

以PTT 為基本碳源，保持質(zhì)量濃度2 g/L 和其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分配比不變，分別設(shè)置4 g/L XSN、6 g/L 豆餅粉、2 g/L XSN+3 g/L 豆餅粉等不同氮源處理，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基最終pH 為7.0，50℃培養(yǎng)并觀察菌體生長(zhǎng)情況，明確不同氮源條件下除硫菌N411 的增殖影響（圖2）。

圖2 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)除硫菌N411發(fā)酵培養(yǎng)的影響

在以2 g/L PTT 為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以豆餅粉作為氮源部分或全部替代無機(jī)氮NaNO3，測(cè)定除硫菌N411 對(duì)有機(jī)氮的利用能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，4 g/L XSN作為氮源培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)較好，50℃培養(yǎng)16 h 后菌體達(dá)最大濃度。2 g/L XSN+3 g/L 豆餅粉的處理中，細(xì)菌繁殖量明顯低于4 g/L XSN的氮源處理，且培養(yǎng)16 h 后菌體自溶，濁度下降。以6 g/L豆餅粉替代XSN作為氮源的培養(yǎng)基中，除硫菌N411幾乎不能繁殖生長(zhǎng)，表明除硫菌N411 能有效利用XSN 等無機(jī)氮作為氮源，而對(duì)蛋白質(zhì)為主要成分的豆餅粉作為有機(jī)氮源幾乎不能利用。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，菌體繁殖生長(zhǎng)與XSN濃度成正相關(guān)。

2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在明確除硫菌N411 適宜碳源、氮源基礎(chǔ)上，通過調(diào)整培養(yǎng)基中碳、氮比例對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化（見表1）。

培養(yǎng)基各組成成分的變化直接影響了除硫菌N411 的菌體生長(zhǎng)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基以PTT、XSN 為基本碳、氮源，能提供菌體發(fā)酵培養(yǎng)的一般需求，但發(fā)酵周期短，生長(zhǎng)不整齊，16 h達(dá)最大OD600值，鏡檢呈現(xiàn)芽孢、孕孢及營養(yǎng)體多種菌體形態(tài)。通過對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方調(diào)整試驗(yàn)表明，XSN 和PTT 是影響除硫菌發(fā)酵培養(yǎng)的關(guān)鍵營養(yǎng)因子，其含量和比例直接影響了菌體的發(fā)酵水平和發(fā)酵周期。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，菌體生長(zhǎng)量與XSN 含量成顯著正相關(guān)，同時(shí)PTT 含量也顯著影響除硫菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明配方1、配方2 都能獲得較高菌數(shù)的發(fā)酵培養(yǎng)液，培養(yǎng)44 h平板測(cè)定單位活菌數(shù)分別達(dá)6.6×107CFU/mL和2.1×107CFU/mL，可以在此范圍內(nèi)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基以提高除硫菌N411的發(fā)酵水平。

圖3 除硫菌N411在不同組成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖動(dòng)態(tài)

2.2 除硫菌的發(fā)酵培養(yǎng)控制條件研究

2.2.1 不同溫度條件對(duì)除硫菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響

不同溫度條件試驗(yàn)結(jié)果表明，除硫菌N411 的生長(zhǎng)對(duì)溫度具有較高的要求，以50～60℃為宜。試驗(yàn)在40℃條件下培養(yǎng)24 h，孢子幾乎不萌發(fā)。在60℃條件下培養(yǎng)孢子萌發(fā)率最高，平均達(dá)236 CFU/皿，隨溫度的提高，孢子萌發(fā)率有所下降（圖4）。從菌落生長(zhǎng)速度來看，萌芽的菌體隨溫度的升高生長(zhǎng)速度加快，以60℃溫度培養(yǎng)單菌落最多，說明60℃更適合菌體生長(zhǎng)（圖5）。

圖4 不同溫度對(duì)除硫菌的孢子萌發(fā)的影響

圖5 不同溫度對(duì)除硫的菌落生長(zhǎng)影響

2.2.2 不同pH值對(duì)除硫菌孢子萌發(fā)的影響

將培養(yǎng)基以1 mol/L HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0 等不同酸堿度，按照方法接入1 mL 稀釋的孢子懸浮液，置于60℃生化培養(yǎng)箱中觀察培養(yǎng)，24 h 檢查培養(yǎng)基平板表面形成的菌落數(shù)，明確不同pH 條件對(duì)除硫菌N411孢子萌發(fā)的影響。

不同pH條件顯著影響除硫菌N411的孢子萌發(fā)（F=46.861，P=0.000）。pH 為4.0 的酸性條件下，孢子萌發(fā)受到顯著抑制，培養(yǎng)24 h 幾乎不萌發(fā)。在酸性條件下隨著pH 值的升高，孢子萌發(fā)率逐步提高，pH 值中性（pH 7.0）條件下達(dá)最大值，單位菌落數(shù)達(dá)237 個(gè)。堿性條件同樣抑制芽孢的萌發(fā)，pH 值大于8.0 以上孢子60℃培養(yǎng)24 h 幾乎不萌發(fā)。說明除硫菌適合在中性條件下生長(zhǎng)（圖6）。

圖6 培養(yǎng)基不同pH值對(duì)除硫菌芽孢萌發(fā)的影響

2.2.3 不同裝液量對(duì)除硫菌生長(zhǎng)狀況的影響

在50 mL 的滅菌的培養(yǎng)基中加入1 mL 除硫菌孢子懸浮液并充分搖勻。分別取4 mL、8 mL、12 mL加入15 mL 的指形管中，每處理重復(fù)6 次。以硅膠塞封口后，置于60℃、230 r/min 的搖床上震蕩培養(yǎng)。間隔4 h 分別取出不用裝液量的試管1 支，測(cè)定OD600值、pH值，并顯微鏡染色觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。

不同裝液量直接影響了培養(yǎng)基中的溶氧濃度，進(jìn)而影響好氧微生物的生長(zhǎng)。裝液少，液體與空氣接觸面積大，溶氧量增加，反之則溶氧量減少。試驗(yàn)結(jié)果表明，除硫菌N411 在不同溶氧條件下都能繁殖生長(zhǎng)，但溶氧量的大小影響到菌體的生長(zhǎng)速度，充足的溶氧量有利于芽孢的形成。4 mL/管裝液量生長(zhǎng)發(fā)育速度快，整齊度高，12 h 達(dá)菌體最高濃度，OD600值達(dá)0.281，伴隨著芽孢形成，pH 逐漸上升，24 h 大部分芽孢脫落完成生長(zhǎng)周期。隨裝液量的增加，菌體生長(zhǎng)速度減緩，發(fā)育進(jìn)度加長(zhǎng)，12 mL/管裝液量24 h菌體形態(tài)仍處于營養(yǎng)體階段，pH值為7.0，未見芽孢形成（表2）。

表2 不同裝液量搖菌試驗(yàn)對(duì)除硫菌N411菌體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.3 除硫菌工業(yè)發(fā)酵過程控制研究

2.3.1 除硫菌的發(fā)酵周期及菌體形態(tài)觀察

除硫菌在配方1 的培養(yǎng)基中，按照控制參數(shù)培養(yǎng)，24 h 完成發(fā)酵周期。接種后4 h，孢子萌發(fā)產(chǎn)生營養(yǎng)體并進(jìn)行對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；接種后8 h 菌數(shù)顯著增多，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，以營養(yǎng)體形態(tài)存在；接種12 h后細(xì)菌在營養(yǎng)體一端開始形成孢囊；接種后16 h，形成孢囊的菌體自溶并釋放出芽孢，20 h 后大部分芽孢脫落并聚集；24 h 后反應(yīng)體系中主要以芽孢形式存在，脫落的芽孢二次萌芽生長(zhǎng)（圖7）。

圖7 除硫菌N411在8M3發(fā)酵體系中菌體生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)

終止培養(yǎng)取樣測(cè)定OD600值達(dá)2.327，顯著高于對(duì)照0.396 的OD600值，平板活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果表明工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的除硫菌N411 菌數(shù)達(dá)2.2×108CFU/mL（圖8）。

圖8 工業(yè)發(fā)酵除硫菌活菌數(shù)測(cè)定

2.3.2 除硫菌發(fā)酵過程pH值變化

伴隨著發(fā)酵過程進(jìn)行，N411 反應(yīng)體系的pH 值也隨之變化。接種時(shí)培養(yǎng)基pH 值為7.0，孢子萌發(fā)進(jìn)入營養(yǎng)生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)4 h 后取樣檢測(cè)pH 值下降至6.5。隨著溶氧增加、蛋白質(zhì)代謝增強(qiáng)，pH 逐步提高，接種后12 h pH 值升高到7.2。16 h后pH 上升至7.5，營養(yǎng)體形態(tài)的菌體開始形成孢囊，伴隨著細(xì)胞自溶，芽孢釋放，反應(yīng)體系pH值上升為7.7（圖11）。

圖11 除硫菌N411在發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH的動(dòng)態(tài)變化

3 結(jié)論

（1）培養(yǎng)基的優(yōu)化研究結(jié)果表明，在碳源選擇上，除硫菌N411 能有效利用PTT 等單糖作為碳源，而對(duì)DF 為碳源的多糖降解利用能力較弱。在氮源選擇上，除硫菌N411 能有效利用XSN 等無機(jī)氮作為氮源，而蛋白質(zhì)為主要成分的豆餅粉作為有機(jī)氮源幾乎不能利用。

（2）N411 發(fā)酵控制條件以溫度、pH、裝液量（溶氧）為主要參數(shù)。通過實(shí)驗(yàn)確定溫度為60℃，pH 值為7.0，裝液量為26.7%。

（3）采用制定的發(fā)酵工藝和控制條件完成了除硫菌N411 的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。所得發(fā)酵產(chǎn)品平板活菌數(shù)達(dá)2.2×108CFU/mL，且菌體整齊度高，無雜菌。