HPLC 法同時測定厚藤不同部位中8 種成分

劉 雯劉 云侯小濤 鐘燕妮

（1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530001；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇徐州 221002；3.廣西中藥藥效研究重點實驗室，廣西南寧 530001）

厚藤Ipomoea pes-caprae（Linn.）Sweet，系旋花科番薯屬草本植物，又稱馬鞍藤、海灘牽牛、二葉紅薯等，在我國主要分布于廣西、廣東、福建、臺灣等東南沿海地區(qū)，植物資源豐富［1］。全草入藥，具有祛風除濕、拔毒消腫的功效，主治風寒感冒、風濕痹痛、癰腫疔毒，外用治瘡癤、痔瘡［2］。厚藤主要含香豆素、萜類、黃酮、生物堿、奎尼酸等成分［3-8］。現代研究表明，厚藤具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗膠原酶、抗氧化、免疫調節(jié)等多種藥理活性［9-12］。迄今為止，有關厚藤質量控制方面的研究報道較少。馮小慧等［13-14］建立了厚藤TLC鑒別方法及HPLC 法測定6 種成分的含量。厚藤的傳統(tǒng)藥用部位是全草，關于其不同部位的比較研究尚未見報道。對中草藥不同部位組分差異的研究具有重要意義［15-18］。本研究采用HPLC 法測定了厚藤不同部位（花、葉、果實、嫩莖、老莖）中8 種成分的含量，以期闡明厚藤不同部位之間的差異，為其質量控制、臨床應用及資源的合理開發(fā)和利用提供參考。

1 材料

Waters e2695 高效液相色譜儀，包括UV 型紫外檢測器、沃特世工作站（美國Waters 公司）；PRACTUM224-1CN 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。水為純凈水；甲醇為分析純；乙腈為色譜純。對照品綠原酸（批號 110753-201817，純度96.8%）、咖啡酸（批號110885-201703，純度 99.7%）、異槲皮苷（111809-201804，純度97.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號6630）、隱綠原酸（批號3208）、異綠原酸B（批號3089）均購自購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；異綠原酸A（批號RP180903）、異綠原酸C（批號RP180704）均購自成都麥德生科技有限公司。4 批厚藤信息見表1，經廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室譚勇教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流動相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫，程序見表 2；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質量濃度分別為0.150 6、0.801 3、0.144 4、0.180 1、0.645 3、1.485 0、2.442 0、1.258 0 mg／mL的混合對照品貯備液，分別精密量取0.40、0.70、1.00、1.30、1.60 mL 至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2.2 供試品溶液 取厚藤粗粉（過2 號篩）約2 g，精密稱定，置具塞磨口錐形瓶中，精密量取70%甲醇20 mL 置錐形瓶中，稱定質量并記錄，回流1 h，取出放涼后，再加70% 甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取“2.2.1”“2.2.2”項下溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖1。理論板數以綠原酸計，不得低于6 000。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 8 種成分含量測定

2.4.1 線性關系考察 取適量“2.2.1”項下混合對照品溶液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1”項色譜條件下進樣分析。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗 取同一份混合對照品溶液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1”項色譜條件下進樣6 次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.3%、0.2%、0.2%、0.3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取厚藤粉末（過2 號篩，編號S1）約2 g，共6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為1.4%、0.9%、1.1%、1.2%、1.5%、0.8%、1.1%、1.2%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取厚藤粉末（過2 號篩，編號S1）約2 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為 1.7%、2.7%、2.1%、2.0%、3.0%、1.3%、2.9%、1.3%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取厚藤粉末（過2 號篩，編號S1）約1 g，平行稱取6 份，按照100%水平精密加入對照品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，計算回收率，結果見表4。

2.4.6 含量分析 取4 批樣品的5 個部位（花、葉、果實、嫩莖、老莖），共20 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表5，可知老莖中咖啡酸含量最高，其他7 種成分含量均在葉中最高。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

3 討論與結論

分別考察了提取方法、提取溶劑、提取時間，結果發(fā)現70%甲醇回流提取1 h 提取率最高。以色譜峰的分離度、峰形、峰面積等為指標考察了液相流動相系統(tǒng)、柱溫、檢測波長，結果發(fā)現乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)效果最佳；327 nm 下各組分有最大吸收，靈敏度高；柱溫對結果影響不大，因此選擇接近室溫的25 ℃。

目前，關于厚藤不同部位比較研究的文獻鮮有報道。本研究建立HPLC 法測定4 批厚藤5 個部位中8 種成分的含量，結果發(fā)現不同部位之間存在統(tǒng)計學差異，其中老莖中咖啡酸含量最高，其他7 種成分含量均在葉中最高。綜上所述，本研究可為厚藤的質量控制、臨床應用，以及相關資源的合理開發(fā)利用提供依據。

表5 各成分含量測定結果（%）Tab.5 Results of content determination of various constituents（%）