UHPLC-PDA 法同時測定毛大丁草中6 種成分

游景瑞 孫 佳蘭燕宇李勇軍王永林劉春花?

（1.貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽 550004；2.貴州醫科大學藥學院，貴州貴陽 550025；3.貴州醫科大學，貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽 550004）

毛大丁草為菊科植物毛大丁草Gerbera piloselloides（Linn.）Cass.的干燥全草，是西南地區少數民族用藥，具有宣肺止咳、發汗利水、行氣活血的功效，常用于治療傷風咳嗽、哮喘、癰癤等疾病［1-4］。目前，對毛大丁草的研究主要集中在成分的分離提取上［5-7］，已從其不同部位分離得到香豆素類、黃酮類、有機酸等83 個化合物［8-9］，可能是其活性物質［10-11］，具有鎮咳、平喘、抗菌、抗腫瘤等藥理作用，在醫藥領域具有很好的應用前景［12-14］，但成分含量測定方法比較單一，如采用RP-HPLC 法、雙波長薄層掃描法測定熊果苷含量［15-16］，HPLC 法同時測定大丁苷、8-甲氧基補骨脂素含量［17］，以及對總黃酮含量的測定［18］，基于多成分含量同時測定的研究尚未見報道。目前，毛大丁草質量標準仍不完善，不能較全面地控制其內在質量。課題組前期已經建立毛大丁草的指紋圖譜，并指認出熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 等成分［19］；本實驗采用UHPLC-PDA 法同時測定毛大丁草中6 種成分的含量，以期為其質量控制方法的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Nexera-i LC-2040C 3D CN 超高效液相色譜儀（UHPLC），包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、脫氣器和光電二極管陣列（PDA）檢測器（日本島津公司）；EL204 電子天平［萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 熊果苷對照品（批號wkq19031511，純度＞98%）購于四川省維克奇生物科技有限公司；綠原酸（批號170510，純度＞98%）購于成都植標化純生物技術有限公司；木犀草苷（批號wkq19013011，純度＞98%）購于四川省維克奇生物科技有限公司；異綠原酸A（批號AF8112193，純度＞98%）、異綠原酸B（批號AF7080124，純度＞98%）、異綠原酸C（批號AF9060921，純度＞98%）購于成都埃法生物科技有限公司。

甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）均購于國藥集團化學試劑有限公司；甲酸（色譜純）購于美國Tedia 公司。毛大丁草由貴州醫科大學藥學院藥用植物學與生藥學教研室張旭副教授鑒定為毛大丁草Gerbera piloselloides（Linn.）Cass.的干燥全草。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質量濃度分別為1.423 0、0.976 1、0.975 1、0.991 8、0.974 1、1.009 4 mg／mL 的貯備液，經稀釋后置同一10 mL量瓶中，30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 質量濃度分別為284.59、19.52、19.50、19.84、38.96、20.19 μg／mL 的混合對照品溶液，于4 ℃保存備用。

2.1.2 供試品溶液 取藥材粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流2 h，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，量取續濾液5 mL 至25 mL 量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，2% A；3～4 min，2%～10% A；4～7.5 min，10% A；10～13 min，15%～17% A；13～18 min，17% A；18～23 min，17%～28% A；23～25 min，28%～50% A；25～30 min，50%～53% A；30～32 min，53%～95% A；32～33 min，95% A）；體積流量0.28 mL／min；檢測波長280、328 nm；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性試驗 取“2.1”項下混合對照品、供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣分析，色譜圖見圖1，可知6 種成分的分離度良好（均＞1.5），雜質干擾小，可用于含量測定。

圖1 各成分UHPLC 色譜圖Fig.1 UHPLC chromatograms of various constituents

3.1.2 線性關系考察 取“2.1.1”項下混合對照品溶液（溶液①），精密吸取5 mL 置于10 mL量瓶中，30%甲醇定容至刻度，搖勻得溶液②，同法制備溶液③④⑤⑥，稀釋成6 個質量濃度的系列混合對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣分析。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果表明各成分在各自范圍內線性關系良好。取上述混合對照品溶液，成比例稀釋后進樣分析，按S／N ＝10、S／N ＝3 分別計算定量限（LOQ）、檢出限（LOD），結果見表1。

3.1.3 精密度試驗 取同一混合對照品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下連續進樣6 次，測得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.52%、0.13%、0.95%、0.27%、0.30%、0.34，表明儀器精密度良好。

3.1.4 重復性試驗 取同一批藥材6 份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，測得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C含量RSD 分別為0.90%、1.63%、1.61%、1.31%、1.55%、1.67%，表明該方法重復性良好。

3.1.5 穩定性試驗 取“2.1.2”項下同一供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD分別為0.27%、0.19%、0.41%、0.31%、0.18%、0.34%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

3.1.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的樣品0.25 g，共9 份，置100 mL 具塞錐形瓶中，分別加入50%、100%、150%水平的對照品各3 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣，計算回收率。結果，熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 平均加樣回收率分別為102.06%、103.37%、104.97%、104.79%、105.21%、104.75%，RSD 分別為1.88%、1.70%、1.20%、1.89%、1.53%、1.25%。

3.1.7 樣品含量測定 收集不同產地藥材，對熊果苷、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量進行測定，結果見表2。由此可知，6 種成分總含量為1.165 8%～7.244 4%，其中熊果苷平均含量最高，異綠原酸A 次之，最低的是木犀草苷。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

表2 各成分含量測定結果（%， n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents（%， n＝2）

3.1.8 聚類分析和主成分分析 采用SPSS 22.0軟件，以6 種成分含量為變量，對30 批藥材進行系統聚類分析，采用組間連接法，以歐氏平方距離為測量標準，結果見圖2。30 批樣品可分成4 類，第一類是S11（貴州凱里），第二類是S19（貴州貞豐）、S28（云南文山）、S29（云南），第三類是S1（貴州貴陽）、S7（貴州貴陽）、S9（貴州凱里）、S14（貴州都勻）、S16（貴州盤縣）、S20（四川）、S22（廣西）、S25（云南）、S26（云南）、S27（云南），其他16 批為第四類。

圖2 30 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of thirty batches of samples

采用SPSS 22.0 軟件，以6 種成分含量為變量進行主成分分析，首先對變量進行標準化，然后計算特征值、貢獻率和累積貢獻率。第一主成分的特征值是4.541，累積貢獻率為75.675%；第二主成分的特征值是0.721，累積貢獻率為12.014%，前兩個主成分的累積貢獻率為87.69% ＞85%，即占毛大丁草藥材中6 種成分信息含量的87.69%，因此可選擇其進行評價。第一主成分反映了熊果苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的信息，而第二主成分反映了木犀草苷的信息，見表3～4。

表3 主成分初始特征值和貢獻率Tab.3 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表4 相關矩陣Tab.4 Correlation matrices

根據主成分分析結果，對6 種成分的含量進行綜合評價，計算主成分得分和綜合得分，利用主成分矩陣得到得分系數矩陣，表達式如下。

Prin 1 ＝0.403 1X1+0.442 5X2+0.296 1X3+0.424 2X4+0.422 8X5+0.441 1X6

Prin 2 ＝-0.199 0X1+0.087 1X2+0.892 7X3-0.328 6X4+0.025 9X5-0.215 5X6

由此可知，第一主成分方差貢獻率最大，包含最多的信息，最大系數是X2，表明綠原酸含量在質量控制中起到了比較重要的作用。綜合評價函數F＝0.756 75F1+0.120 14F2，再計算30 批樣品的綜合得分和排序，見表5。

4 討論

本實驗分別考察了不同提取溶劑（乙醇、甲醇、30%甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇）、提取方式（超聲、回流、索氏）和提取時間（1、2、3 h），結果發現50%甲醇作為溶劑，加熱回流提取2 h 效率最高，雜質最少。

分別考察了不同流動相系統，包括甲醇-水、乙腈-水，發現后者分離效果較好。同時考察了不同流動相pH（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%冰醋酸水、乙腈-0.1% 甲酸水）、不同色譜柱、不同體積流量、不同柱溫和不同進樣量等，最終選擇“2.2”項下條件。

表5 主成分得分、綜合得分排序Tab.5 Ranks of principal component scores and comprehensive scores

毛大丁草含有多種化學成分，主要有酚酸類、黃酮類等，均具有明顯的生物活性［20-23］，本研究發現，6 種成分中熊果苷含量最高，木犀草苷最低，提示熊果苷的含量可作為毛大丁草質量控制的重要指標。聚類分析結果表明不同產地之間各成分含量差異較大，且同一地區藥材質量并不統一，可能與不同氣候和不同采收期等因素有關。主成分分析結果表明，S11 批樣品的綜合得分為3.223 9，居首位，同時其綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 等咖啡酰基奎寧酸總含量最高，表明其成分含量較好；而S13 批的綜合得分最低，綠原酸等咖啡酰基奎寧酸總含量也最低，提示綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 等咖啡酰基奎寧酸的含量與毛大丁草的品質可能存在相關性，且以綠原酸的含量為主。本研究建立了UHPLC-PDA 含量測定方法，可以同時對毛大丁草中6 種成分進行定量分析，其中熊果苷、綠原酸的含量在毛大丁草藥材中占重要地位。