去氫紫堇堿對(duì)慢性炎性痛小鼠痛行為學(xué)及脊髓炎癥因子表達(dá)的影響

殷智宇 阮文晴 孫 龍 魏 盼 宋建鋼

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院麻醉科，上海 201203

炎性痛機(jī)制復(fù)雜，臨床治療棘手且治療效果欠佳[1]。研究表明，促炎和抗炎細(xì)胞因子失衡導(dǎo)致的脊髓神經(jīng)炎癥是慢性痛發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因[2-3]。去氫紫堇堿（dehydrocorydaline，DHC）是中藥延胡索中的一種小檗堿單體，動(dòng)物和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，DHC 具有抗炎作用[4-5]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，單次腹腔注射DHC 可在福爾馬林疼痛模型中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6]，但DHC 是否通過調(diào)控脊髓促炎和抗炎因子的表達(dá)緩解脊髓神經(jīng)炎癥，治療慢性炎性痛尚不清楚。本研究以完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的慢性炎性痛小鼠模型為研究基礎(chǔ)，觀察DHC 是否可以調(diào)控脊髓促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，緩解小鼠的痛覺過敏。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只雄性ICR 小鼠，6～8 周，體重28～32 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0001，合格證號(hào)：44002100206635。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

DHC（純度≥98%，徐州微科曼得生物有限公司，貨號(hào)：VIC449），CFA（美國Sigma 公司，貨號(hào)：F5881），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）一抗、白細(xì)胞介素（IL）-1β一抗、IL-6 一抗、IL-10 一抗（英國Abcam 公司，貨號(hào)分別為：ab6671、ab2105、ab6672、ab134742），動(dòng)態(tài)足底觸覺儀、熱輻射刺激儀（意大利UgoBasile 公司，型號(hào)：Model 37450、30370）。

1.3 方法

1.3.1 分組與給藥 將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組10 只，分別為Sham 組、CFA 組和CFA+DHC組。造模前測定小鼠基礎(chǔ)痛閾值。Sham 組小鼠足跖中部皮下注射25 μL 生理鹽水，CFA 組和CFA+DHC 組小鼠足跖中部皮下注射25 μL CFA 建模。小鼠于造模后1～7 d，CFA+DHC 組小鼠每天腹腔注射10 mg/kg DHC（劑量參考本研究前期已發(fā)表文章[6]），CFA 組小鼠腹腔注射溶媒（10% DMSO），給藥后30 min 進(jìn)行痛行為學(xué)測定。

1.3.2 慢性炎性痛造模 小鼠俯臥位，使用微量注射器在小鼠右后足跖中部皮下注射25 μL CFA[7-8]。

1.3.3 機(jī)械痛閾值的測定 使用動(dòng)態(tài)足底觸覺儀測量小鼠的機(jī)械縮足反射閾值（the paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。將小鼠放入儀器中，適應(yīng)環(huán)境安靜后，使用金屬線垂直地壓向小鼠足底中央表面，壓力均勻增加，陽性反應(yīng)為足退縮或后肢回縮，此時(shí)壓力值即為PWMT。重復(fù)測量3 次，取3 次平均值為PWMT[9]。

1.3.4 熱痛閾值的測定 使用熱輻射刺激儀測量小鼠的熱縮足反射潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。在小鼠適應(yīng)環(huán)境后將光點(diǎn)照射于小鼠足底中部皮膚，陽性反應(yīng)為下肢出現(xiàn)特征性的回縮或抬起，此時(shí)儀器自動(dòng)切斷電源，并顯示時(shí)間，數(shù)值即為PWL。重復(fù)測量3 次，取3 次平均值即為PWL[10]。

1.3.5 Western blot 檢測小鼠脊髓促炎因子和抗炎因子的表達(dá) 造模7 d 后，取小鼠脊髓腰膨大，裂解組織后靜置30 min，離心速度12 000 r/min，離心半徑15 cm，時(shí)間20 min，收集上清液，按BCA 蛋白測定試劑盒（英國Abcam 公司，ab102536）說明確定樣本蛋白濃度，于SDS 聚丙烯胺凝膠上恒壓電泳，電轉(zhuǎn)至PVFD 膜上，加一抗TNF-α（1∶800）、IL-1β（1∶1000）、IL-6（1∶1000）、IL-10（1∶1000）和β-actin（1∶1000），4℃過夜，PBST 漂洗濾膜，加入二抗孵育2 h，使用ECL 系統(tǒng)檢測免疫復(fù)合物，Image J 軟件分析條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），采用重復(fù)測量的方差分析或單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni 法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)腹腔注射DHC 對(duì)慢性炎性痛小鼠PWMT 的影響

整體分析發(fā)現(xiàn)：組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。提示各時(shí)間點(diǎn)、各組間的PWMT 均存在差異，且處理因素對(duì)PWMT的作用會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：Sham 組造模前后PWMT 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。造模后，CFA 組、CFA+DHC 組PWMT 較造模前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。組間比較：造模前，三組PWMT 基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；造模后1～7 d，與CFA 組比較，CFA+DHC 組PWMT 升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 連續(xù)腹腔注射DHC 對(duì)慢性炎性痛小鼠PWMT 的影響（g，）

表1 連續(xù)腹腔注射DHC 對(duì)慢性炎性痛小鼠PWMT 的影響（g，）

注：與本組造模前比較，aP ＜0.05；與Sham 組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP ＜0.05；與CFA 組同時(shí)間點(diǎn)比較，cP ＜0.05。DHC：去氫紫堇堿；PWMT：機(jī)械縮足反射閾值；CFA：完全弗氏佐劑

2.2 連續(xù)腹腔注射DHC 對(duì)慢性炎性痛小鼠PWL 的影響

整體分析發(fā)現(xiàn)：組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。提示各時(shí)間點(diǎn)、各組間的PWL 均存在差異，且處理因素對(duì)PWL 的作用會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：Sham 組造模前后PWL 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。造模后，CFA 組、CFA+DHC 組PWL 較造模前縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。組間比較：造模前，三組PWL 基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；造模后1～7 d，與CFA 組比較，CFA+DHC 組PWL 延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表2。

2.3 DHC 對(duì)慢性炎性痛小鼠脊髓促炎性細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響

造模后，與CFA 組比較，CFA+DHC 組脊髓TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；與CFA 組比較，CFA+DHC 組脊髓IL-10蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

表2 連續(xù)腹腔注射DHC 對(duì)CFA 慢性炎性痛小鼠PWL 的影響（s，）

表2 連續(xù)腹腔注射DHC 對(duì)CFA 慢性炎性痛小鼠PWL 的影響（s，）

注：與本組造模前比較，aP ＜0.05；與Sham 組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP ＜0.05；與CFA 組同時(shí)間點(diǎn)比較，cP ＜0.05。DHC：去氫紫堇堿；PWL：熱縮足反射潛伏期；CFA：完全弗氏佐劑

3 討論

小鼠足底注射CFA 后可引起明顯且持續(xù)時(shí)間較長的炎性痛，是慢性炎性痛經(jīng)典模型[11-12]。本研究中，小鼠右后足底皮下注射CFA 后1～7 d 均可觀察到顯著的痛覺過敏，表現(xiàn)為致炎足PWMT 明顯降低、PWL明顯縮短，提示造模成功。

DHC 是中藥延胡索中的一種活性堿成分[13-14]。分子藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DHC 具有抗炎、抗腫瘤、心血管系統(tǒng)保護(hù)等多方面藥理作用[15～19]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，單次腹腔注射DHC 可顯著緩解小鼠福爾馬林炎性痛[6]。但是連續(xù)使用DHC 對(duì)慢性炎性痛治療的效果，以往鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)腹腔注射7 d DHC，可顯著提高小鼠的PWMT 和PWL，證實(shí)了連續(xù)使用DHC治療慢性炎性痛的有效性。

圖1 DHC 對(duì)慢性炎性痛小鼠脊髓促炎性細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響（n=10）

外周炎性損傷發(fā)生后，脊髓水平的炎性細(xì)胞因子表達(dá)隨著損傷時(shí)間發(fā)生變化，產(chǎn)生中樞敏化，導(dǎo)致慢性炎性痛[20-21]。脊髓神經(jīng)免疫反應(yīng)過程中，膠質(zhì)細(xì)胞激活后，釋放多種細(xì)胞因子，包括促炎性細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎細(xì)胞因子（如IL-10），當(dāng)促炎因子和抗炎因子表達(dá)失衡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答平衡被打破，則產(chǎn)生脊髓神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致慢性炎性痛的發(fā)生發(fā)展[22～26]。本實(shí)驗(yàn)CFA 慢性炎性痛模型小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)顯著增高，IL-10表達(dá)顯著降低，與行為學(xué)痛閾值下降一致，DHC 治療7 d，可顯著降低CFA 小鼠脊髓促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表達(dá)，并增加抗炎細(xì)胞因子IL-10蛋白的表達(dá)，說明DHC 可通過調(diào)節(jié)抗炎和促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。但DHC 具體是通過何種途徑調(diào)節(jié)脊髓促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，DHC 可緩解CFA 慢性炎性痛小鼠的疼痛，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脊髓促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。