循環游離核酸分子標志物在腎細胞癌診治中的研究進展

黃帥帥，岑東

作者單位： 315010 寧波，寧波市鄞州區第二醫院

腎癌是一類來源于腎小管上皮系統的惡性腫瘤，其中腎細胞癌（RCC）占腎臟所有原發性惡性腫瘤的80%～90%，發病率僅次于膀胱癌居泌尿系統惡性腫瘤的第二位。RCC 對常規放化療不敏感，目前手術治療是局部RCC 的主要治療手段，而免疫治療、靶向藥物和化學療法是針對晚期和轉移性RCC 首選治療方法。雖新的RCC 診斷方法和治療藥物方面取得了重大進步，但其發病率和死亡率仍然很高，且日益上升，嚴重威脅人類健康。因此，篩選靈敏度高、特異性強的RCC分子標志物以提高其早期診斷、改善遠期療效已成為當前相關研究的熱點之一。外周血循環游離核酸（CNAs）是指在人體外周血中游離于細胞外的核酸片段，主要有循環游離脫氧核糖核酸（cfDNA）和循環游離核糖核酸（cfRNA）兩類。腫瘤患者的CNAs 往往含有與腫瘤部分遺傳物質相一致的特征性改變，借助于分子生物學技術，在腫瘤發生早期，即可從患者外周血中檢測到腫瘤特異性CNAs，為腫瘤的無創診斷、性質確定、腫瘤細胞分化與進展乃至預后評估提供重要依據，有助于腫瘤臨床診斷和用藥指導。本文就近年來這一領域的主要研究進展綜述如下。

1 cfDNA

cfDNA是存在于人體外周血并游離于細胞外的DNA 片段。早在20 世紀40 年代，有研究發現人外周血中可分離出CNAs 分子，然而并未受到廣泛關注。直至1994 年，Sorenson 等在胰腺癌患者外周血中發現了與其腫瘤組織相一致的K-ras突變基因，認為該突變基因由腫瘤細胞釋放并具腫瘤特異性，可用于腫瘤的診斷、治療及預后評估。之后陸續有研究發現腫瘤患者cfDNA 存在DNA 序列反轉、缺失、點突變、微衛星改變及啟動子甲基化等異常。

由于cfDNA 在人外周血中以雙鏈形式存在，故其穩定性較好。cfDNA 的來源目前尚無定論，一般認為主要由腫瘤細胞以非致病性地凋亡和壞死途徑釋放進入外周血，健康人群中含量為1 ～10 ng/ml，而腫瘤患者中顯著增加，這種差異使得cfDNA 具備作為腫瘤分子標志物的特征，為腫瘤臨床早期診斷、預后及隨訪提供無創、便捷和高效的檢測方式。

RCC 患者的外周血cfDNA 表達量高于健康對照人群，并且隨著RCC 血管侵犯程度增加，其cfDNA 完整性下降。另外，cfDNA 表達量與RCC 預后效果呈負相關，腎切除術后出現復發的RCC患者的血cfDNA 水平高于未復發者，這表明cfDNA 在RCC 血行轉移方面具有潛在的預測價值。除了細胞核來源的cfDNA外，外周血中線粒體來源的cfDNA（mt-cfDNA）在健康人群和RCC 患者中也存在顯著差異。Lu 等在檢測RCC 轉移患者、非轉移患者與健康對照人群血mt-cfDNA 時發現，mt-cfDNA 含量在RCC 轉移組最高，RCC 非轉移組次之，健康對照組最少；mt-cfDNA 完整性與RCC 惡性轉移程度呈負相關。此外，無論是來源于移植瘤小鼠模型還是腫瘤患者血中的mt-cfDNA，其平均片段長度均比健康對照組短，且與腫瘤負荷及cfDNA 濃度呈負相關。因此，mt-cfDNA可作為診斷RCC的重要分子標志物。

2 cfRNA

雖然人類基因組中約70%DNA被轉錄為RNA，但是非編碼RNA 占98%以上。非編碼RNA 通過與疾病關聯因子的相互作用，在疾病發生發展過程中發揮重要的調控作用。cf-ncRNA 是一種存于人外周血并游離于細胞外的非編碼RNA片段，包括循環游離微小RNA（cf-miRNA）、循環游離長鏈非編碼RNA（cf-lncRNA）、循環游離環狀RNA（cf-circRNA）等。通常，外周血中的cf-ncRNA 受蛋白質修飾或包裹于囊泡中以免受RNA酶的水解，從而保持穩定的狀態。越來越多的研究表明，cf-ncRNA 對RCC 的診斷與預后具有重要的臨床意義。

2.1 cf-miRNA miRNA作為一類進化保守的非編碼小分子RNA，由單鏈RNA 前體經Dicer 酶和Drosha酶剪切加工而成，長度為18 ～22 個核苷酸。作為一種反義轉錄物，miRNA 通過與靶mRNA 3‘UTR的堿基配對而使之受切割，從而在轉錄水平上實現對靶基因的調控。雖然miRNA 在細胞內并不直接翻譯成蛋白質，但其可通過下游效應分子、靶基因之間的相互作用網絡調控腫瘤細胞生物學行為。

研究發現，cf-miRNA可作為RCC的潛在診斷標志物。Lou 等研究發現，cf-miR-144-3p 在ccRCC 患者外周血中顯著上調，尤其在晚期pT 期，是一種較好的診斷ccRCC 的血生物標志物。Wang 等發現，在術后第7 天ccRCC 患者的外周血中cf-miR-483-5p水平增加。同時，cf-miR-483-5p 的高表達與腫瘤的低分期呈正相關，然而與中性粒細胞與淋巴細胞比率（NLR）和淋巴細胞與單核細胞比率（LMR）呈負相關；cf-miR-483-5p 的過度表達可導致上皮-間充質轉化（EMT）過程的逆轉，抑制RCC細胞的增殖和轉移。因此，miR-483-5p 的表達與炎癥狀態呈負相關，可能是ccRCC 的一個潛在的外周血生物標志物。除了上述幾種cf-miRNA，miR-210、miR-211、miR-1233 和miR-429 均被證明可作為RCC 的診斷因子。多種cfmiRNA 聯合診斷RCC 比單種具有更高的診斷準確性。Redova 等發現，相比于正常健康人群，RCC 患者外周血中cf-miR-378 上調，cf-miR-451 下調，cfmiR-378 和cf-miR-451 的ROC曲線下的面積（AUC）分別為0.71 與0.77；若將兩者聯合診斷AUC為0.86，高于任何一種cf-miRNA 的診斷準確性。

此外，cf-miRNAs 與RCC 患者生存率、預后效果及臨床分期均密切相關。Tusong 等發現，RCC 患者外周血中的cf-miR-21、cf-miR-106a 水平均高于健康對照組，但在腎切除術后1 個月，兩者表達水平均顯著降低，這提示cf-miR-21、cf-miR-106a 水平與RCC負荷具有相關性，可作為RCC預后的潛在分子標志物。Fedorko等也認為血cf-miR-378、cf-miR-210可能成為診斷RCC 術后預后效果的分子標志物。此外，還發現miR-378 水平升高與無病生存期及臨床分期呈正相關。Chanudet 等發現，Ⅲ和Ⅳ期的晚期ccRCC 患者cf-miRNA 表達譜與健康對照組或處于早期的ccRCC患者間存在較大差異，這提示cf-miRNAs 可能為診斷RCC 的進展提供一些依據。

2.2 cf-lncRNA lncRNA作為一種長度超過200 個核苷酸的RNA分子，雖然不直接編碼蛋白來調控細胞功能，但可通過多種不同機制來調控基因表達和蛋白合成。近年研究認為，lncRNAs 可作為致癌或抑癌因子調節腫瘤的發生和進展，以lncRNAs 為靶點的腫瘤治療研究目前正陸續開展。

lncRNAs 的表達具有組織特異性，且其特殊結構使得其在外周血中不易被降解而相對穩定存在。雖cf-lncRNA 作為腫瘤的分子標志物及其調控機制已有較多研究報道，但與RCC 關聯報道較少。lncRNA GIHCG作為一種最早在肝細胞癌中被發現的 lncRNA，其可通過招募轉錄因子 EZH2 和DNMT1 到miR-200b/a/429 啟動子并與之結合，可從表觀遺傳層面抑制miR-200b/a/429 表達，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移過程。He 等發現，與癌旁組織相比，lncRNA GIHCG 在RCC 組織或外周血中均處于高表達狀態，并與患者的TNM分期、Fuhrman 分級及預后不良呈正相關。因此，以血cflncRNA GIHCG 水平區分RCC 和健康人群準確性較好（敏感性為87%，特異性為84.8%，AUC=0.920）。此外，在RCC根治術后患者血cf-lncRNA GIHCG 水平也隨之降低，證實外周血的cf-lncRNA GIHCG 可能來源于RCC 組織；通過細胞功能實驗發現，GIHCG 基因敲除后RCC 細胞的增殖和遷移受到顯著抑制。因此，認為cf-lncRNA GIHCG 可用于RCC診斷、預后及藥物靶點。

lncRNA 可通過靶向miRNA 來調控細胞功能。lncPANDAR 作為原癌性因子，已被證實與RCC 的預后呈負相關，與下游的miR-1204 和miR-1207 功能抑制相關。lncRNA-LET 被認為是可以抑制多種腫瘤發生的一種抑癌因子，其機制是通過靶向miR-373-3p 來調節Wnt 信號拮抗劑Dickkopf 1 和組織金屬蛋白酶抑制物-2（TIMP-2）的表達，從而擾亂線粒體膜電位，誘導細胞發生凋亡。lncRNA 也會通過與靶基因競爭miRNA的結合位點，對靶基因的表達以及功能發揮產生影響。由于lncRNA PTENP1與PTEN 的3’非編碼區具有高度同源性，PTENP1扮演了競爭性內源RNA（ceRNA）的角色，與PTEN競爭性靶向結合miR-21，調節PTEN 基因介導的RCC 細胞的增殖、遷移和侵襲過程。相類似的是，lncRNA PVT1 可作為ceRNA 招募miR-200s，調控ZEB1、ZEB2 和BMI1 的表達，從而影響RCC 細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

lncRNA 還可作為RCC 耐藥的預測指標。通常，RCC 耐藥性是其臨床治療中的主要難題。Qu 等發現，RCC細胞株對舒尼替尼產生耐藥后，lncARSR表達水平明顯增加。與正常對照人群相比，RCC 患者血清中cf-lncARSR 顯著性增加；患者行RCC 手術治療后其cf-lncARSR 水平發生下調，然而在腫瘤復發時又發生上調。因此，血cf-lncARSR 可以作為預測患者用藥后PFS 的獨立指標。分子機制研究發現，lncARSR通過競爭性結合miR-34/miR-449，促進RCC 細胞內AXL 和c-MET 表達，并進一步激活下游STAT3、AKT 和ERK 信號通路，導致RCC 對舒尼替尼產生耐藥性，此外，具有生物活性的lncARSR可以整合到外泌體中，將舒尼替尼耐藥性傳遞到臨近腫瘤細胞或其他部位內的敏感RCC 細胞。相反，以lncARSR、AXL或c-MET為靶點的核酸療法可以恢復耐藥細胞株對舒尼替尼的應答。上述研究證實lncARSR 與RCC 耐藥相關，有可能作為RCC 靶向用藥療效的預測因子。

2.3 cf-circRNA circRNA 作為一種閉合環狀結構的RNA，與miRNAs 和lncRNAs 類似，也是一類非編碼RNAs。但與線性RNAs 不同的是，circRNAs 無5’與3’端，其形成一個閉合連續環，這種特殊結構使得其較線性RNA更加穩定，以免受血液RNA酶的降解。circRNA 通過結合腫瘤關聯的miRNA，發揮其競爭性內源RNA 的調控機制，充當“海綿”功能，進而影響miRNA對其靶基因的調節作用，調控腫瘤細胞功能。Ma 等在分析RNA 微陣列數據時發現，相比于癌旁組織，RCC 組織中共有324 個circRNA 下調，218 個circRNA上調，以此為基礎構建了一個circRNA-miRNA-mRNA 相互作用網絡。Xiao 等在研究中發現，RCC 患者外周血囊泡或腫瘤組織中，其circ-400068 的水平均高于健康對照組。體外機制研究證實，circ-400068 通過調控下游分子miR-210-5p/SOCS1 軸促進RCC細胞的增殖并抑制其凋亡過程，這提示circ-400068 可以作為RCC 治療的新靶點。Huang等在研究中發現，circABCB10 在RCC腫瘤組織中顯著高于其癌旁組織。同時，5 種RCC 細胞株（ACHN、Hs891.T、A498、Caki-2 和Cal-54 細胞）circRNA水平均高于正常腎小管上皮細胞株（HREC細胞）。circ-ABCB10 的表達與晚期病理分級和腫瘤淋巴結轉移分期呈正相關，與RCC 患者預后呈負相關。此外，HHLA2、Hsa-circ-0001451 和circPCNXL2均可作為預測RCC 預后的核酸標志物。

2.4 循環游離YRNA YRNA 作為一種新型的非編碼RNA 分子，由RNA 聚合酶III 轉錄而成，具有與其互補的5’和3’UTRs 形成特征性的莖環結構，序列具有高度保守性。YRNA包括YRNA1、YRNA3、YRNA4 和YRNA5 四種不同的轉錄本。通常情況下，YRNA分子與小RNA結合核酸外切酶保護因子SSB 或者Ro60s 結合，使其在轉運過程中保持穩定，不受核酸酶所降解。

YRNA 在多種腫瘤中呈高表達，若YRNA1 或YRNA3 表達受到抑制，將導致細胞增殖能力下調。Nientiedt 等發現，相對于正常腎組織，RCC 組織中YRNA3 和YRNA4 表達顯著增加，且YRNA4 表達量與進展期RCC 及淋巴結轉移均呈負相關關系，但尚未發現兩者在RCC 患者和正常健康人群外周血表達水平的差異。因此，cf-YRNA 對RCC 的診治價值尚需深入研究。

2.5 循環游離Piwi 蛋白相互作用RNA piRNA 是近年來新發現的一類非編碼小RNA分子，最初發現時認為piRNA 主要參與維持遺傳物質的穩定性。但最新研究表明，piRNA 參與調控腫瘤抑制基因的甲基化，促進細胞發生“干細胞化”改變，從而促進腫瘤的發生和發展進程。

有研究證實，piRNA 的異常表達與多種癌細胞增殖、分化、進展和轉移形成有關，這提示其在腫瘤形成中扮演重要角色。Ren 等檢測了6 對RCC 組織及配對的癌旁組織的piRNA 水平，發現有19 個piRNA表達異常，其中piRNA-31115 在RCC組織的表達量顯著高于癌旁組織。此外，細胞實驗發現piRNA-31115 在Caki-1 及786-O細胞均呈高表達，若通過特異性抑制劑下調piRNA-31115 的表達，則細胞增殖能力受顯著性抑制。因此，認為piRNA-31115可能是RCC 治療的分子靶點。此外，piR-32051、piR-39894、piR-43607、piR-30924 和piR-38756 的高表達與其轉移和預后均呈負相關。Iliev 等發現在RCC組織中piR-823 水平與患者的無疾病生存期呈負相關；RCC 患者血清中cf-piR-823 水平高于健康對照組，且與RCC 晚期分期呈正相關，這提示piR-823 可作為預測RCC 患者預后的潛在標志物。

3總結與展望

CNAs在腫瘤發生發展的進程中扮演重要作用，已成為當前醫學研究的熱點。CNAs 所具有的高穩定性及組織特異性等特征，使其有望成為RCC 診斷與預后的分子標志物。然而，CNAs 在常規臨床檢驗的應用并不多，需要進一步進行臨床轉化。未來，關于CNAs 的研究仍有許多值得探索的方向：（1）建立RCC CNAs 表達譜，深入研究其與人群、種族之間的相關性；（2）設立統一的樣本采集、檢測及數據分析的質控標準；（3）開發CNAs標志物聯合的檢測，以提高診斷準確性與操作便捷性；（4）探索除血液外其他更易獲得的體液樣本（如尿液、唾液以及汗液等）用于診治RCC 的可能性。隨著腫瘤分子診斷的快速發展，CNAs 將會給RCC 患者的診治帶來新希望。

(參考文獻略，讀者需要可向編輯部索取)