MicroRNA在幽門螺桿菌陰性胃癌中的研究進展*

王 璐 李學良

南京醫科大學第一附屬醫院消化內科(210029)

胃癌是常見的上消化道惡性腫瘤之一，盡管在過去的50年中，胃癌的發病率和死亡率在世界范圍內有所下降，但仍是第三大癌癥相關死亡原因[1]。早期一項前瞻性隊列研究[2]表明，胃癌僅發生在幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)感染陽性患者中。然而后續的研究結果顯示，在部分胃癌患者中未發現Hp感染的證據，該類型胃癌被定義為幽門螺桿菌陰性胃癌(Helicobacterpylori-negative gastric cancer, HpNGC)[3]。與幽門螺桿菌陽性胃癌(Helicobacterpylori-positive gastric cancer, HpPGC)相比，HpNGC具有不同的臨床病理特征和預后[3-4]。說明HpNGC的發病機制可能與HpPGC并不完全相同。

已有研究表明HpNGC和HpPGC之間存在差異表達的microRNA(miRNA)，說明miRNA在HpNGC的發病中起有重要作用[5-6]。MiRNA是一種內源性非編碼小RNA，存在于真核細胞中，由21～25個核苷酸組成[7]，可調節慢性炎癥性疾病和各種腫瘤性疾病的發生。正確認識HpNGC并深入了解相關miRNA在其中的致病機制，有助于闡明HpNGC相關的生物學標志物以及新型治療靶標的鑒定。本文就HpNGC中差異表達且起致病作用的miRNA及其機制和相關治療靶點作一綜述。

一、HpNGC的概述

1. HpNGC的定義和診斷：HpNGC定義為無Hp現癥感染、既往感染和既往可疑感染時所發生的胃癌。結合既往研究文獻，診斷HpNGC需同時滿足以下條件[3,8]：①無Hp現癥感染：快速尿素酶試驗、尿素呼氣試驗、組織切片染色鏡檢等檢查至少一項為陰性；②無Hp既往感染：無Hp感染史和根除史，且血清Hp抗體為陰性；③無Hp既往可疑感染：a. 無組織病理學萎縮和腸化生；b. 無內鏡下萎縮，且胃體下部有規律排列的小靜脈；c. 無血清學萎縮，即血清胃蛋白酶原(pepsinogen, PG)檢測陰性(PGⅠ>70 ng/mL，PGⅠ/Ⅱ>3.0)。

目前研究表明胃黏膜萎縮和腸化生主要由Hp感染引起[9-10]。嚴重的萎縮和腸化生會導致Hp無法定植而自發消失[11]，且由于抗菌藥物治療其他疾病時可能會意外根除Hp[12]，故臨床檢測Hp感染會出現假陰性結果，因此評估胃黏膜萎縮是有必要的。目前發現嚴格定義下的HpNGC患病率為0.42%～5.4%[3-4]。

2. HpNGC的病因：關于HpNGC的病因和發病機制目前尚不完全明確。除Hp感染外，目前已知胃癌的患病風險與多種因素有關，其中生活方式因素占主導作用。一項在中國胃癌高危地區進行的配對病例對照研究[13]表明，吸煙、反流、情緒經常較差增加了HpNGC的發病風險。此外，病毒感染、自身免疫病、家族聚集性和種系突變等因素也可能導致了HpNGC的發生。

二、HpNGC中差異表達的miRNA

多種miRNA在HpNGC與HpPGC之間存在差異表達，可作為研究胃癌發生和預后的分子基礎。了解miRNA在HpNGC中的致病機制并鑒定早期診斷標志物，對HpNGC分子遺傳學的進一步研究至關重要。目前發現在HpNGC中表達上調的miRNA包括miR-204-5p、miR-338-5p、miR-135b-5p、miR-93、miR-372、miR-122、miR-455、miR-200a-5p、miR-943、miR-25等；在HpNGC中表達下調的miRNA包括miR-99b-3p、miR-564、miR-143-3p、miR-145-5p、miR-146a、miR-302a、miR-302b、miR-196b、miR-138等[5-6,14-19]。

三、在HpNGC中表達上調的miRNA

1. MiR-338-5p：Chang等[5]的研究應用miRNA微陣列檢測8例HpNGC和8例HpPGC組織標本之間miRNA的表達譜，結果顯示miR-338-5p在HpNGC組織中的表達增高，而在HpPGC中表達降低。MiR-338-5p已被確定為胃癌的潛在調節因子，與胃癌患者較短的總生存期和無復發生存期有關[20]。由此推測，miR-338-5p過表達可能與HpNGC患者預后不良有關。

2. MiR-25：Abdi等[19]發現miR-25在HpNGC中表達上調，而在HpPGC中表達降低。Ning等[21]的實驗證實miR-25-3p過表達在體外可顯著促進胃癌細胞生長和侵襲，在體內抑制miR-25-3p表達可抑制腫瘤的發生。Kong等[22]證實胃癌血清miR-25高表達與較晚的疾病分期顯著相關。在按腫瘤大小、浸潤深度和淋巴結轉移分層的亞組分析中，高血清miR-25水平與預后不良相關。He等[23]的研究發現miR-25表達在順鉑耐藥的胃癌細胞中上調，并通過抑制FOXO3a表達以促進細胞周期進程。抑制miR-25表達可導致細胞周期阻滯，并增強胃癌細胞對順鉑的化療敏感性。由此推測，靶向miR-25可能是治療HpNGC腫瘤轉移和順鉑耐藥的有前景的方法。

3. MiR-135b-5p：Lee等[6]的研究發現miR-135b-5p在HpNGC和HpPGC中的表達均明顯增加，但在HpNGC中的表達約為HpPGC中的3倍，說明兩者存在著部分相同的致癌機制。Chen等[24]的研究發現Krüppel樣因子4(KLF4)是miR-135b-5p的靶點，miR-135b-5p通過靶向并下調KLF4在胃癌細胞中的表達，從而發揮促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和有絲分裂以及降低細胞凋亡的作用，因此抑制miR-135b-5p表達對HpNGC有治療價值。Lu等[25]的研究結果顯示，CMTM3為miR-135b-5p的另一直接靶點，miR-135b-5p過表達可抑制CMTM3表達，促進胃癌的進展和轉移。MiR-135b-5p/CMTM3軸的發現為預測HpNGC預后、開發治療策略提供了一個新的方向。

4. MiR-93：Liu等[15]的研究構建了HpNGC和HpPGC的競爭內源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)調控網絡，結果發現HpNGC ceRNA網絡中存在9種特有的miRNA，其中miR-93在調控網絡中RNA的相互作用數中位列第一，推測其可能是中樞基因，在整個網絡和疾病發生中發揮重要作用。Guan等[26]發現胃癌組織中miR-93高表達與較高的TNM分期顯著相關。在功能上，miR-93的異位表達在體外可促進細胞增殖、遷移、侵襲、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并抑制細胞凋亡和G1細胞周期阻滯，在體內促進腫瘤形成。進一步實驗結果表明，TIMP2是miR-93的直接靶標，miR-93通過靶向TIMP2在胃癌發生中起著腫瘤啟動子的作用。Shen等[27]發現miR-93-5p過表達通過靶向下調AHNAK表達來激活Wnt信號通路，并可抑制典型上皮細胞標志物E-cadherin表達而增加間質標志物vimentin和Snail表達，從而促進胃癌的EMT。EMT是分化的上皮細胞失去上皮特征并獲得間充質細胞遷移性的生物過程，是腫瘤轉移過程中的重要環節，可增強細胞遷移和侵襲能力，與癌癥的侵襲和轉移過程密切相關。由此可見，miR-93可能在HpNGC的發生和進展過程中起有舉足輕重的作用，有望成為HpNGC診斷的生物學標志物和治療靶標。

5. MiR-372：MiR-372是HpNGC調控網絡中特有的miRNA之一，其在HpNGC中的表達上調[17]。Zhou等[28]的研究結果顯示miR-372直接靶向并下調TNFAIP1表達，參與調節NF-κB信號通路，促進胃癌細胞增殖并抑制細胞凋亡，在控制細胞生長和凋亡中起致癌作用。Wang等[29]發現，上調miR-372表達可靶向調控FOXO3a并抑制其表達，促進胃癌細胞增殖，減少凋亡并可增強順鉑的耐藥。Pan等[30]的研究發現ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2可能為胃癌的潛在調控軸，在胃癌的發病中起有關鍵作用。上述研究提示miR-372、ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2軸可作為HpNGC治療的潛在靶點，并有望解決HpNGC化療耐藥的問題。

四、在HpNGC中表達下調的miRNA

1. MiR-146a：Shomali等[16]的研究表明miR-146a在HpNGC中表達下調，而在HpPGC中上調，并可促進HpNGC細胞遷移；功能研究表明miR-146a是一種腫瘤抑制因子，其低表達預示著較差的無復發生存率。Kipkeeva等[31]發現miR-146a表達降低與胃癌區域淋巴結轉移和遠處轉移的發生有關，可作為胃癌轉移風險的生物學標志物。Chen等[32]的研究發現miR-146a可通過靶向TAK1抑制NF-κB信號通路，從而促進胃癌細胞凋亡。在化療和預后方面，Luo等[33]發現miR-146a通過調節其靶基因LIN52影響晚期胃癌的化療敏感性和預后，miR-146a低表達的腫瘤患者的化療敏感性和預后均較差。由此可見，miR-146a可作為HpNGC抗轉移替代治療的候選基因。

2. MiR-143-3p：Wang等[14]的研究發現與鄰近非癌組織相比，HpNGC中miR-143-3p表達降低，而在HpPGC中的表達升高，并發現AKT2是miR-143-3p的功能靶點。MiR-143-3p通過直接靶向AKT2基因來調控腫瘤的生長、遷移和侵襲，是一種腫瘤抑制性miRNA。MiR-143-3p表達下調可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，并促進細胞遷移和侵襲。該研究還發現miR-143-3p低表達與臨床分期和腫瘤轉移密切相關，導致HpNGC患者的預后較差。Fan等[34]發現lncRNA CCDC144NL-AS1可海綿化miR-143-3p，并上調其直接內源性靶基因MAP3K7在胃癌中的表達，從而促進細胞增殖、侵襲和遷移并抑制細胞凋亡，在胃癌發生、發展中起致癌的作用。CCDC144NL-AS1/miR-143-3p/MAP3K7軸為進一步探究HpNGC的發病機制和治療提供了啟示。

3. MiR-145-5p：Lee等[6]的研究發現與非癌組織相比，HpNGC中miR-145-5p表達明顯降低，而在HpPGC中表達無明顯變化。Jiang等[35]的研究提示miR-145-5p活性降低與EMT的增加有關。MiR-145-5p可通過直接靶向N-cadherin和ZEB2來抑制EMT，從而抑制胃癌細胞侵襲和遷移。MiR-145-5p作為抑癌基因，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期有關，因此其表達下調與患者較差的預后相關。Teng等[36]發現SERPINE1為miR-145-5p的靶標，lncRNA NKX2-1-AS1表達在胃癌細胞株和腫瘤組織中上調，其充當負調控miR-145-5p的ceRNA。LncRNA NKX2-1-AS1/miR-145-5p軸可誘導SERPINE1的翻譯，從而激活VEGFR-2信號通路，促進腫瘤進展和血管生成。Zhou等[37]證實了ANGPT2為miR-145-5p的另一靶標，miR-145-5p過表達可通過抑制ANGPT2來抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。上述研究結果表明NKX2-1-AS1/miR-145-5p/SERPINE1軸和miR-145-5p/ANGPT2/Nod樣受體軸可能為HpNGC潛在的治療靶標。

4. MiR-138：Yang等[18]的研究發現miR-138在HpNGC中表達下調。Pang等[38]的實驗證實SOX4是miR-138在胃癌細胞中的直接靶點，而SOX4是EMT的主要介導因子。蛋白質印跡法結果顯示miR-138過表達通過上調上皮標志物E-cadherin、下調間質標志物N-cadherin和vimentin來抑制胃癌細胞的EMT進程。功能分析表明，miR-138過表達抑制了胃癌細胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲，并可抑制體內腫瘤的生長；而胃癌中miR-138低表達與TNM分期有關。提示miR-138可作為HpNGC的治療靶點。Sun等[39]的研究結果證實miR-138為lncRNA MCM3AP-AS1的下游靶標，lncRNA MCM3AP-AS1通過海綿化miR-138，從而上調FOXC1的表達來促進胃癌對順鉑的耐藥性。上述研究可能為HpNGC的治療和化療耐藥提供一種新的解決途徑。

5. MiR-196b：MiR-196b表達和功能的研究結果仍存在爭議。Yang等[18]的生物信息學分析和實驗發現HpNGC中miR-196b表達明顯低于HpPGC。生存分析表明，miR-196b-3p與胃癌患者的預后顯著相關，miR-196b-3p表達較低的患者預后較差。相反，Abdi等[19]的研究發現miR-196b在HpNGC中表達上調，而在HpPGC中表達降低。Li等[40]的研究證實miR-196b表達上調可通過調節PI3K/AKT/mTOR途徑來促進胃癌細胞的增殖和侵襲能力。由此可見，miR-196b在HpNGC中的表達和作用仍需行進一步的研究。

由于既往研究中納入的病例存在對HpNGC定義不嚴格的問題，部分差異表達的miRNA(如miR-196b)在不同研究中的表達呈相反的趨勢。因此HpNGC中差異表達的miRNA及其致病機制的研究仍需結合嚴格的診斷標準行進一步探討。

五、LncRNA-miRNA-mRNA在HpNGC中的分析

將miRNA置入其發揮作用的網絡中來研究HpNGC的發病機制具有重要意義。一個或多個miRNA應答元件被mRNA和lncRNA共享，lncRNA可作為天然的miRNA海綿，導致細胞內miRNA功能的下調[41]。由lncRNA-miRNA-mRNA構建的ceRNA網絡在癌癥的發生、發展、侵襲和轉移中起重要作用。

Liu等[15]構建了HpNGC和HpPGC的ceRNA調控網絡以探究兩者間的差異，并首次報道了miRNA在HpNGC的ceRNA網絡中的關鍵作用。結果顯示HpPGC中三種差異表達的RNA數量均少于HpNGC，說明HpNGC具有較高的異質性。進一步GO分析顯示HpNGC富集于細胞分化、細胞周期、凋亡過程、血管發育和ERK級聯；KEGG通路富集分析發現，HpNGC的ceRNA網絡的獨特通路包括細胞周期、肌動蛋白細胞骨架的調節和環磷酸腺苷信號通路。這項研究結果可能為進一步探究miRNA和ceRNA網絡在HpNGC中獨特的致病機制提供了依據。

六、小結與展望

Hp感染是目前胃癌的主要致病因素，然而隨著人們對Hp根除治療的重視，HpNGC的患病率未來將有上升的趨勢，并有可能成為更常見的胃癌類型。因此需要深入認識HpNGC，并針對HpNGC制定新的癌癥預防、治療策略。由于目前HpNGC發病率低，既往部分研究對HpNGC的納入標準的制定并不嚴格，未來應進行嚴格納入標準的大樣本研究，從而更有利于準確探究HpNGC差異表達的miRNA和其他分子標志物。目前對于HpNGC的病因、危險因素和致病分子機制的相關研究較少，進一步找尋HpNGC的患病高危因素并探究其發病的分子機制對未來胃癌的預防和治療有重要意義。