春秋兩季油樟葉的油細胞形態、精油成分及其抗氧化活性研究

程 賢，畢良武*，李勝男，陳玉湘，趙振東，莫開林

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室；國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室；江蘇省生物質能源與材料重點實驗室；江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210042；2.四川省林業科學研究院，四川 成都 610081)

油樟是中國特有的樟科樟屬樹種，主要分布在我國的四川省，此外，湖南、廣東、重慶等省市也有種植[1]。油樟精油的主要成分包括醇類、烴類、酯類、醛類等[2]。醇類成分以1,8-桉葉油素和α-松油醇為主，烴類以萜類為主，包括γ-松油烯、α-蒎烯和石竹烯等[3]。油樟精油的主要成分具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用，是天然抗氧化劑的重要來源，具有廣闊的應用前景[4-6]。李嘉欣等[7]采用DPPH、ABTS、FRAP法對樟樹精油的體外抗氧化活性進行評價，研究表明：油樟精油質量濃度為8 g/L時，對DPPH自由基的清除率約20%，對ABTS自由基也有一定的清除能力。王藝蓓等[8]用近紅外技術對加入油樟精油樣品的 DPPH和ABTS溶液進行光譜分析，結果表明：油樟精油對兩種自由基具有較高的清除率。史峻銘等[9]研究表明采用低共熔溶劑微波輔助蒸餾法獲得的油樟精油對ABTS自由基的清除能力遠高于DPPH自由基。由此可見，油樟精油在治療氧化應激相關疾病，如癌癥、糖尿病和心血管疾病方面具有一定的藥用價值，在開發食品天然防腐劑及抗氧化劑等方面具有廣闊的應用前景。因此，油樟精油的化學成分和生物活性研究仍然是油樟研究的重點。目前，對不同季節油樟葉的精油化學成分及抗氧化活性變化的研究未見報道，同時對于不同季節油樟油細胞形態變化也鮮有報道。本研究以不同季節采集的油樟葉為研究對象，首先利用光學顯微鏡對油細胞密度、直徑進行對比研究，利用掃描電鏡(SEM)在超微水平上進一步觀察油細胞；其次利用GC-MS對水蒸氣蒸餾法提取所得精油進行成分分析，利用GC對精油主成分進行含量測定；最后對精油的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力進行評價，初步探索不同季節對油樟葉精油品質的影響，以期為油樟葉的科學采集提供參考。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

1,8-桉葉素(純度98%)、α-松油醇(純度95%)和γ-松油烯(純度95%)均購自上海麥克林生化科技有限公司；戊二醛水溶液(體積分數2.5%)，國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸(Vc)、氫氧化鈉、雙氧水、無水乙醇和甲醇均為分析純。

島津GC-2014AF氣相色譜(GC)儀，配有Rtx-5型石英毛細管色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μmol/L)，FID 檢測器，日本島津儀器有限公司；7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)儀，美國安捷倫公司；S3400-I型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本日立公司；Eclipse E200生物顯微鏡，日本尼康儀器有限公司；LD-UPW-V超純水制備儀，上海礫鼎水處理設備有限公司；AB135-S十萬分之一電子天平；FZ102型植物粉碎機；TGL-16B高速離心機。

1.2 油樟葉的采集

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li)，樹齡為10年，在四川省宜賓市翠屏區思坡鎮會詩村隨機選擇10棵樹作為樣株，分別于春季(2019年5月)和秋季(2019年11月)采集葉樣。每次采樣時，在每棵樣株的東、西、南、北不同方位分別等量采摘，并充分混合，作為試驗用葉樣[10]。

1.3 油細胞形態研究

1.3.1光學顯微鏡測量 在油樟葉片中下部且無葉脈處，剪取5 mm×5 mm的樣本，浸泡在5%的氫氧化鈉水溶液中，在65 ℃恒溫箱內放置48 h，取出后先用水沖洗2次，然后于雙氧水中浸泡15 min，最后取出樣本置于載玻片上，小心蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。盡快使用生物顯微鏡對處理好的樣本進行觀察和拍攝，在10倍視野下拍攝樣本，并記錄油細胞數目作為該樣本中油細胞的密度，在40倍視野下借助Image View軟件中的測量工具對油細胞直徑進行測量[11]。

1.3.2掃描電鏡分析 在油樟葉片中下部且無葉脈處，剪取2 mm×10 mm的樣本，立即投入電鏡固定液(2.5%的戊二醛水溶液)，抽氣至樣本沉底，在室溫環境下固定2 h，經過冷凍干燥后，放入離子濺射儀中，在5 Pa的真空度、30 mA的電流下噴金鍍膜30 s。使用掃描電子顯微鏡對處理好的樣本進行觀察和拍攝[12]。

1.4 油樟精油的提取及成分研究

1.4.1精油的提取 將油樟葉片適度粉碎，碎片約5 mm×5 mm，準確稱量40 g粉碎后的葉片放入蒸餾器中，連接好揮發油提取器，開始加熱蒸餾，待揮發油提取器中有冷凝水流出開始計時，5 h后停止加熱，收集上層精油，并精確稱質量，在2～8 ℃冰箱內保存備用。針對兩種試驗用葉樣分別進行3次平行實驗，以油樟葉片的干質量計算精油的提取得率。

1.4.2GC-MS分析 將提取所得油樟精油樣品用乙醇稀釋5倍，使用0.45 μm濾頭過濾，采用GC-MS分析其化學成分和含量。GC-MS分析所采用的氣相條件：色譜柱為Rtx-5石英毛細管柱；載氣為He，1.6 mL/min；進樣口溫度為280 ℃；進樣量為0.2 μL；分流比為100 ∶1；色譜柱升溫程序為50 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升至280 ℃保持20 min。質譜條件：EI電離源，電離源溫度為230 ℃，電子轟擊能量為70 eV，掃描質核比(m/z)范圍為50～500。

1.4.3GC分析 分別精密稱取1,8-桉葉素、α-松油醇和γ-松油烯3種對照品，用乙醇配制成約120 g/L的對照品母液。各取100 μL的3種對照品母液混合，得到各對照品質量濃度約為40 g/L的混合對照品母液，梯度稀釋至約0.05、1、5、10和20 g/L，膜過濾以供GC測量分析，以對照品濃度為橫坐標，GC峰面積為縱坐標繪制標準曲線。精密移取提取所得油樟精油樣品，用乙醇稀釋40倍，微孔濾膜過濾以供GC測量分析。GC分析采用GC-MS分析時所使用的氣相條件。

1.5 油樟精油抗氧化活性研究

1.5.1總抗氧化能力 用無水乙醇將提取所得油樟精油樣品配制成不同質量濃度梯度(0.01～10.00 g/L)的待測液，按照總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒說明書進行操作。在520 nm 測定樣品吸光度，以抗壞血酸(Vc)溶液為陽性對照，以無水乙醇作為空白對照。在37 ℃時，每毫升樣品使反應體系的吸光度值每分鐘增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位，由此計算油樟精油的總抗氧化能力(U/mL)[13]。

1.5.2DPPH自由基清除能力 用無水乙醇將提取所得油樟精油樣品配制成不同質量濃度梯度(0.01～10.00 g/L)的待測液，取不同質量濃度的待測液0.5 mL，加入0.5 mL DPPH乙醇溶液，混勻室溫放置30 min，測定517 nm處的吸光度，以Vc溶液為陽性對照，以無水乙醇作為空白對照。根據公式計算油樟精油的DPPH自由基(DPPH·)清除率[14]。

式中：ηDPPH·—DPPH·清除率，%；At—樣品吸光度；A0—空白吸光度。

1.6 數據處理

實驗數據以平均值±標準偏差表示，平行實驗≥3次，并使用SPSS19.0軟件進行方差分析和檢驗。

2 結果與討論

2.1 油細胞差異分析

a.春季spring，×10；b.春季spring，×40;c.秋季autumn，×10；d.秋季autumn，×40圖1 油樟葉片中油細胞形態Fig.1 Oil cell morphology in leaves of C.longepaniculatum

2.1.1油細胞形態 圖1(a)和(c)為普通光學顯微鏡10倍視野下所拍攝的春秋兩季油樟葉片中油細胞的形態。由圖可知油樟葉片中的油細胞以單個的形式分布于薄壁組織中，大多數分布在脈間區，少數分布在脈上，因此油細胞與其他組織細胞相比較，在分布形式上具有明顯的區別[15]。隨機挑選3張10倍視野下拍攝的照片，并統計該視野下油細胞的數量，結果表明：春季和秋季油樟葉片的油細胞密度分別為(41±3)和(38±2)個/mm2，說明春季油樟葉片中油細胞密度偏大。圖1(b)和(d)為普通光學顯微鏡40倍視野下所拍攝的油樟葉片中油細胞的形態，由圖可知油細胞為圓形或橢圓形。隨機挑選1張40倍視野下拍攝的照片，并測量該視野下油細胞的直徑，結果表明：春季和秋季油樟葉片的油細胞直徑分別為(51.87±1.64)和(36.89±2.64) μm，說明春季油樟葉片中油細胞直徑偏大。推測是春季油樟葉光合速度較快，吸收營養物質的能力較強，進而促進了油細胞的形成和增長。

2.1.2亞細胞結構 圖2(a)和(d)為分別為春秋兩季油樟葉片中油細胞的SEM圖，在2 000倍視野下可以觀測到油樟葉片中油細胞為橢圓球，細胞邊緣明顯，與光學顯微鏡的觀測結果一致，隨機選擇2處油細胞的邊緣位置放大至20 000倍，在超微水平上進一步觀察油細胞的細胞壁結構，如圖2(b)、(c)、(e)和(f)所示。

春季spring：a.×2 000；b.×20 000；c.×20 000秋季autumn：d.×2 000；e.×23 000；f.×21 000圖2 油樟葉片中油細胞的SEM照片Fig.2 SEM images of oil cell in C.longepaniculatum leaves

由于圖中細胞壁僅有初生纖維素壁層，初步推斷采集的葉片樣本中油細胞均尚未發育成熟[16]，可能處于細胞發育的第一階段。圖1(b)和1(d)所拍攝的油細胞尚未呈現為一個大油囊，細胞質尚未完全解體，屬于油細胞發育第一階段的特征。因此，圖2(b)、(c)、(e)、(f)和圖1(b)、(d)的拍攝結果相互驗證，均表明本研究所采集的春季和秋季油樟葉中油細胞均處于細胞發育的第一階段。春秋兩季細胞壁厚度的平均值分別在1.65和0.63 μm左右，說明春季油樟葉油細胞在細胞發育第一階段的細胞壁厚度大于秋季油樟葉，可能與春季油樟葉光合速度較快有關。

2.2 油樟精油提取得率及成分分析

2.2.1油樟精油提取得率 分別計算春季和秋季油樟葉扣除水分后的油樟精油提取得率，結果表明：春季和秋季油樟葉的精油提取得率分別為4.45%和3.09%。所采集的油樟葉中油細胞處于細胞發育的同一階段，但是春季油樟葉油細胞密度和細胞直徑均大于秋季油樟葉，這可能是導致春季油樟葉精油提取得率高于秋季油樟葉的重要原因。

2.2.2油樟精油化學成分 將春季和秋季油樟葉提取所得精油進行GC-MS分析，通過NIST標準質譜庫以及PubMed數據庫，共鑒定出16個化學物，利用峰面積歸一化法計算各化合物的含量，最終結果見表1。由表1可知，春秋兩季所采集油樟葉精油的主要化學成分相同，1,8-桉葉油素為含量最高的成分，相對峰面積超過50%，在秋季油樟葉中含量高。α-松油醇相對峰面積超過20%，在春季油樟葉中含量高。β-水芹烯相對峰面積超過5%，在春季油樟葉中含量高。其他相對峰面積超過1%的化合物分別是β-蒎烯、4-松油醇和γ-松油烯，均在秋季油樟葉中含量高。

表1 不同季油樟葉的精油成分Table 1 Volatile compounds identified in C.longepaniculatum leaves essential oil from different seasons

2.2.3油樟精油主成分含量 為了進一步精確地比較春秋兩季油樟精油主要成分的含量，借助GC對其進行準確測定。首先利用GC對1,8-桉葉素、α-松油醇和γ-松油烯對照品所配制的標準溶液進行測定，以峰面積為縱坐標，對照品質量濃度為橫坐標繪制出3種對照品的校正曲線，結果見表2。

表2 GC測定主要成分含量結果Table 2 The contents of main compounds measured by GC

3條校正曲線的校正系數均≥0.999，在相應的定量范圍內可用于樣品中主要成分的含量計算。計算結果表明：3個主要成分在油樟精油中含量順序由大到小為1，8-桉葉素>α-松油醇>γ-松油烯，其中1，8-桉葉素和γ-松油烯在秋季精油中略高，α-松油醇在春季精油中略高，這與GC-MS峰面積歸一化法計算結果一致。對3次測量結果分別進行差異顯著性分析，結果表明T檢驗的P值均大于0.05，3種主要成分在春秋兩季油樟精油中的含量沒有顯著性差異。

2.3 油樟精油抗氧化活性分析

2.3.1總抗氧化能力 春秋兩季油樟葉提取所得油樟精油及Vc在不同質量濃度時的總抗氧化能力見圖3(a)。由圖可見，2種油樟精油的總抗氧化能力都隨著溶液質量濃度的增加先增強而后趨于穩定，與Vc總抗氧化能力隨質量濃度變化的趨勢相同。春秋兩季油樟葉提取所得油樟精油的總抗氧化能力在溶液質量濃度為0.8～2.0 g/L時達到最大，分別為6.50和5.50 U/mL，約等于Vc總抗氧化能力的40%，其中春季油樟葉提取所得油樟精油總抗氧化能力略高。

2.3.2DPPH·清除能力 隨著油樟精油和Vc的質量濃度增加，各種物質對DPPH·的清除率均表現為先增加最后趨于穩定(見圖3(b))。當質量濃度低于1.0 g/L時，油樟精油的DPPH·清除能力隨質量濃度的增加而逐漸增加。計算各物質的IC50值，春秋兩季油樟葉提取所得油樟精油的IC50均為0.2 g/L。由此可知，油樟精油在清除DPPH·方面具有較好活性，并且兩種油樟精油的清除DPPH·自由基能力基本沒有差異。

a.總抗氧化能力total antioxidant capability;b.DPPH·圖3 油樟精油的體外抗氧化性能Fig.3 The in vitro antioxidant properties of C.longepaniculatum essential oil

3 結 論

3.1利用光學顯微鏡和掃描電鏡對春秋兩季油樟葉中油細胞的形態進行差異分析。結果表明：春季油細胞的細胞密度、細胞直徑和細胞壁厚度均大于秋季油細胞。

3.2春季油樟葉的油樟精油提取得率高于秋季葉，GC-MS的鑒定結果表明春秋兩季油樟精油主要成分均為1，8-桉葉素、α-松油醇和γ-松油烯。1,8-桉葉素和γ-松油烯在秋季油樟精油中的含量略高，α-松油醇在春季油樟精油中含量略高。

3.3春秋兩季的油樟精油抗氧化能力與溶液濃度有較強的相關性，溶液質量濃度為0.8～2.0 g/L時達到最大，約等于Vc總抗氧化能力的40%，春季油樟精油總抗氧化能力略高。春秋兩季油樟精油在清除DPPH自由基方面具有較好活性，IC50均為0.2 g/L，基本無差異。