基于全場光學相干層析圖像的人體肝組織癌變定量特征分析研究

張欣萌，高萬榮*，朱 越，徐新宇

（1. 南京理工大學電子工程與光電技術學院，南京 210094；2. 江蘇省腫瘤醫院病理科，南京 210009）

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，在醫學上經常通過觀察肝組織圖像來判斷肝組織是否發生癌變［1-7］。目前應用于肝癌臨床診斷的成像方法主要有兩種，即X線計算機斷層掃描（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。CT具有高的密度分辨力，可以更好地顯示由軟組織構成的器官，如腦、脊髓、縱隔、肺、肝、膽、胰以及盆部器官等，并能在良好的解剖圖像背景上顯示出病變的影像［4］。但是，CT掃描在低血供方面的診斷還存在較大問題，在診斷時可能會出現漏診的情況，影響檢出率［5-6］。相比于CT成像，MRI擁有多個成像參數，且在軟組織醫學成像上的對比度更好，可任意方向斷層成像，對人體無電離輻射傷害［7］。然而CT和MRI對于肝臟組織成像的分辨率有限，不能夠對微小的結構進行觀察。為了能夠更全面地了解肝癌組織與正常肝組織的區別，從微觀上將它們予以區分，我們提出采用全場光學相干層析（full field optical coherence tomography，FFOCT）系統來對正常肝組織與肝癌組織進行成像。

FFOCT系統基于Linnik結構干涉儀，利用生物組織的后向散射光與參考光的弱相干干涉來提取生物組織的結構信號，并通過計算機進行圖像處理，從而進行層析成像。1998年，Beaurepaire等［8］提出了全場光學相干層析術這一概念，該試驗系統的建立是為了彌補光學相干層析（optical coherence tomography，OCT）系統的很多不足。首先，FFOCT系統采用面陣電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）對樣品進行并行掃描，可一次性得到帶有二維信息的圖像，比進行逐點掃描的OCT系統成像速度更快；其次，FFOCT系統采用鹵鎢燈作為光源，并在參考臂和樣本臂兩臂放置兩個完全相同的顯微物鏡，這樣不僅得到了更高的橫縱向分辨率，降低了成本，而且避免了信號的串擾［9-10］。與普通顯微鏡相比，由于FFOCT系統中僅使用測量信號的干涉分量來產生正面斷層圖像，故能夠在抑制背景強度的同時增強圖像的對比度［11］。與熒光顯微鏡相比，FFOCT系統不需要標記或者預處理，大大節省了成像時間。與共聚焦顯微鏡相比，FFOCT系統提供了更大的對比度和成像深度［12］。

由于FFOCT系統具有活體成像、非侵入、非破壞性、實時、快速、無需標記或預處理、橫縱分辨率高、檢測靈敏度高等諸多優點，目前其已被用于診斷固定和非固定組織樣本。美國圣路易斯華盛頓大學生物醫學工程系首次報道了利用FFOCT系統對人類卵巢組織樣本所成的FFOCT圖像進行定量形態學分析和特征提取，并以此來辨別正常和惡性的人類卵巢組織樣本［13］。法國巴黎Langevin研究所使用FFOCT系統對小鼠肝臟、人類肺癌、人類乳腺組織、人類視網膜、角膜以及指紋等進行了檢測成像［14-19］。本課題組也曾使用FFOCT系統對洋蔥、豬肝、人體結腸與腎臟組織、肝組織等進行了層析成像以及基礎的形態分析等［10，20-22］。

目前對使用FFOCT系統獲得的組織圖像的分析主要是基于觀察者對所得的FFOCT圖像的常規經驗的判斷，即根據樣本的生物學特性以及形態特征對所得到的FFOCT圖像進行辨識，尋找已知的基本結構和組織單位，從而進行判斷和鑒別［21，23］。雖然經過訓練的病理學家和專業人士可以對大部分FFOCT圖像作出正確的解釋，但是在面對一些組織結構發生細微改變的樣本的FFOCT圖像時，他們無法直接用肉眼判斷其是否是癌變組織。此時應考慮對這種FFOCT圖像進行定量分析，從FFOCT圖像中尋找能夠判斷出生物組織是否發生癌變的特征參數，避免因人為因素導致判斷結果不準確，從而增加FFOCT系統在生物醫學臨床應用中的可行性。

搭建基于Linnik結構干涉儀的FFOCT系統并對人類正常與癌變肝組織分別進行成像，結果發現對于癌變特征明顯的肝組織FFOCT圖像，可以根據正常肝組織與癌變肝組織不同的特性，通過肉眼辨識出人類肝組織FFOCT圖像是正常的還是發生癌變的。顯然，對一些早期肝癌或者處在正常與癌變區域的邊界處的病變，由于生物組織結構變化細微，僅憑肉眼并不能直接從圖像中辨別出來。為了使FFOCT系統獲取的光學斷層圖像能應用于肝組織癌變的早期診斷以及準確確定正常與癌變區域的邊界，本研究對所獲得的正常肝組織FFOCT圖像和癌變肝組織FFOCT圖像分別進行了形態學分析與灰度特征提取，以便為病理學醫生進行定量癌癥診斷提供新的手段。

首先，根據已知的正常與惡性癌變肝組織的形態學差異，選取具有代表性的特征參數，對FFOCT圖像進行灰度特征提取。我們先從正常和癌變肝組織的FFOCT圖像的標準化直方圖中定量提取五個特征，這些特征分別是平均值、方差、偏度、峰度和熵值。接下來，為了驗證這五個特征參數的值在正常與癌變肝組織FFOCT圖像中是不同的，我們求出所有的肝組織FFOCT圖像的五個特征參數的值，利用統計學中的t檢驗尋找正常與癌變的肝組織的FFOCT圖像的特征參數的值的區別。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

本試驗所使用的樣本由江蘇省腫瘤醫院病理科提供，分別是人體正常肝組織與人體癌變肝組織。樣本離體后用生理鹽水保存，以便在試驗過程中使用。

1.2 FFOCT系統成像原理

圖1顯示了搭建的FFOCT系統的結構的原理圖。該系統主要由柯勒照明系統和Linnik結構干涉儀組成。使用鹵鎢燈（中心波長為550 nm，光譜帶寬為200 nm，相干長度為1.5μm）作為光源，在降低成本的同時也更加的安全。柯勒照明系統不僅提供了均勻的照明光，而且使得照明范圍隨時可調。使用一對完全相同的顯微物鏡［Olympus，20×，數值孔徑（numerical aperture，NA）為0.5］，兩個顯微物鏡與樣品和參考鏡之間無需放置其他光學器件，這樣使得使用大數值孔徑顯微物鏡成為可能，因此可以獲得更高的橫向分辨率。釔鋁石榴石晶體（yttrium aluminate-garnet，YAG）作為參考鏡附著在壓電陶瓷（piezoelectric ceramics，PZT）的前端，并使用PZT改變光程來進行四步移相，從而提取干涉信號。另外，Linnik結構的參考臂和樣品臂可以獨立調節，這樣就可以獨自對兩臂的光程進行調整。由于光源采用的是鹵鎢燈，相干長度極短，故只有樣品臂和參考臂之間的光程差接近完全相等時才能發生干涉并具有最大的相干強度，這時樣品與參考鏡之間的像才能被恢復出來。因此，參考鏡在軸向移動的過程中可以選擇與樣品中光程相等的對應層進行成像，而其他層的信息將會被濾掉，這就是光的相干斷層成像。面陣CCD（Matrox Iris GT300，像元大小為7.4μm×7.4μm，幀率為110 frame/s）用來采集干涉信號。試驗測得所搭建的FFOCT系統的橫向分辨率為1.65μm，軸向分辨率為1.3μm，由于測量的樣本不同，故成像深度為50～300μm。

圖1 全場光學相干層析系統原理圖Fig. 1 Schematic of full-field optical coherence tomography system

主系統中，光源發出的光經過柯勒照明系統到達分光棱鏡（beam splitter，BS）。分光棱鏡將光源發出的光分為兩部分：一部分經過顯微物鏡到達參考鏡后返回；另一部分經過另一個顯微物鏡到達樣本后返回。返回后的兩束光經過會聚透鏡到達CCD發生干涉，獲得的圖像通過計算機進行圖像處理，得到最終需要的FFOCT圖像。

面陣CCD上任意一點P（x，y）接收到的信號可以表示為：

式中：I0（x，y）為非相干光形成的背景光，Ai（x，y）為第i層的點P（x，y）處的振幅，cos［?（x，y）］為點P（x，y）處的干涉信號。為從得到的CCD信號中解調出層析圖像，我們應用四步移相法，對參考臂的光程進行調制，此時CCD接收到的信號可以表示為［21］：

故最終得到的第i層的點P（x，y）處的層析信號為：

式中n代表參考臂移相時不同位置的編號，I1、I2、I3、I4分別為參考臂的相位移動為時CCD所接收到的信號。Ai（x，y）表示樣品與參考鏡的互相關光強，也是我們要求的層析信號。這里，Ai（x，y）與重建的正面斷層圖像的灰度值成正比。因此，（x，y）越大，則對應的第i層的點（x，y）處的灰度值越大。

1.3 人體離體肝組織的FFOCT圖像分析

在影像學診斷中，分化差的肝細胞癌由于異型明顯等可直接鑒別出是否發生癌變。而在本試驗中需要關注的則是早期高分化的肝細胞癌，這種癌癥具有體積小、邊界清、細胞的異型性不甚明顯的特點。但肝細胞癌中細胞密度增加更為明顯、肝板紊亂、形成小梁和假腺管、肝竇不規則擴張、間質浸潤等也是重要的鑒別指標［24-25］。本文主要研究的是肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。

試驗采用了FFOCT系統對正常與癌變的肝組織成像并通過計算機進行處理。試驗中，我們先得到肝組織表面的圖像，再逐漸改變樣本的軸向位移，對其樣本表面下20、40、60μm等深度分別進行成像，直到無法顯示出樣本的結構信息為止，最后再使用計算機對原始圖像進行處理。從處理后的結果圖像中分別選取效果較好的15幅正常肝組織FFOCT圖像和15幅癌變肝組織FFOCT圖像。15幅癌變肝組織FFOCT圖像記為A組，15幅正常肝組織FFOCT圖像記為B組，從A、B兩組中分別選取1幅圖像，如圖2所示。

圖2 FFOCT系統對肝組織成像的正面斷層圖Fig. 2 En face images of human liver tissue with FFOCT

對于肝的FFOCT圖像如上圖2所示。這些細胞具有大的圓形核，圖2a中細胞質環繞在直徑20μm左右的核仁處，故被認為是肝細胞，而肝竇則是可膨脹的血管通道，又能明顯可見正常的肝組織纖維帶。而圖2b中明顯是肝組織的病灶特征，但無法判斷出具體的病變類型。

這里值得指出的是，在采集圖像之前，首先進行的是樣本區域的選擇，選取成像效果較好的癌變肝組織區域以及正常肝組織區域。其次再進行圖像的采集與處理，進而重建FFOCT正面斷層圖像。本工作中所得到的FFOCT圖像的視場大小為400μm×300μm。定量分析就是對整張圖像的灰度特征進行提取分析。因此，本文中的定量分析結果對應的就是一系列整張的FFOCT圖像。

1.4 FFOCT圖像特征提取

由圖2可知，對肝的FFOCT正面斷層圖像作出正確的判斷，需要有充分的理論依據。首先，要知道所檢測的疾病的具體特征，譬如分化差的 HCC由于異型明顯、浸潤生長及癌栓、衛星灶明顯而較易診斷，但早期高分化小HCC的鑒別則需要更為細致的判別。早期高分化 HCC體積小、邊界清、細胞異型性并不明顯，但其具有細胞密度增加更為明顯、肝竇明顯擴張不規則等特點［24］。如變異肝細胞病灶（focus of altered hepatocytes，FAH）就是由形態不同以及化學表型不同的細胞構成的，具有一定的不穩定性和異質性。由于肝癌的情況較為復雜，為了對FFOCT圖像作出正確的判斷，要求判別圖像的工作人員要具備較高的專業能力，否則有可能引起圖像誤判。然而，對肝組織的FFOCT正面斷層圖進行特征提取，以定量的形式來描述得到的FFOCT正面斷層圖像可以避免上述情況。

對于醫學圖像特征提取算法，大體可以分為三大類： 顏色（灰度）特征提取、紋理特征提取和形狀特征提取。而FFOCT圖像屬于灰度圖像，在此主要進行灰度特征提取。基于對圖像的分析，目前采用如下幾個統計量來反映FFOCT圖像的特征。

其中x是第i個像素的灰度級，N是像素總數。為圖像的平均像素強度，σ為圖像的像素灰度值的標準差，p（xi）為概率，即灰度級為x的像素所占的比例，可由灰度直方圖獲得［10］。均值可以體現平均像素強度。方差可以體現圖像灰度直方圖分布的離散程度。偏斜度反映圖像直方圖分布的不對稱性，偏斜度的值越大，說明圖像越不對稱。峰度指的是圖像直方圖的平坦度。熵值被用來表示圖像的不規則性。我們按照公式（4）～（8）分別對A、B兩組的圖像進行處理并使用統計學的方法對得到結果進行分析。

2 結果與分析

我們對兩組圖像均進行了五個特征參數的計算，并得到了十組不同的數據。為了增加結果的可讀性以及科學性，我們將分析每個特征參數在這兩組圖像中的不同之處。在此，我們選用統計學中的箱型圖以及t檢驗進行分析，得到結果如圖3所示。

圖3 正常肝組織與癌變肝組織的箱型圖與P值Fig. 3 Box plots and P values of normal liver tissues and cancerous liver tissues

由圖3a可知，肝癌的FFOCT圖像與正常肝組織的FFOCT圖像相比，圖像平均強度較低，兩者差異顯著，故均值可以作為區分肝組織是否癌變的標準之一。由圖3b～3d可知，肝癌的不對稱性較小，較平坦且離散程度也是較小的，而正常肝組織與之剛好相反，故肝組織癌變與否也可以用這三者作為評判標準。由圖3e可知，肝癌組織熵值的分布與正常肝組織熵值的分布沒有規律，且P＞0.05，表明兩組數值沒有顯著差異，故不能將熵值作為評判一幅肝組織FFOCT圖像是否癌變的標準。

通過對正常肝組織與早期肝癌組織FFOCT圖像的分析與計算發現，肝組織FFOCT圖像的均值、偏度、峰度與方差均可以作為評判一個肝組織樣本是否發生癌變的參考值，而熵值則不能。由于選取的這些灰度特征都沒有考慮圖像的空間特性，故不能認為用其中某一個特征參數就可以對一幅FFOCT圖像作出評判。為了能夠提高判定的準確度，我們不能只使用一個特征參數，而是需要多個特征參數同時測量，相互驗證，來得到更加準確的試驗結果。本試驗證明可以使用人體肝組織FFOCT圖像的灰度特征來驗證人體肝組織是否發生癌變。在今后的工作中，我們應結合臨床醫學的需求，首先選取多組不同癌變種類的肝組織樣本對其進行層析成像，并對所成的FFOCT圖像進行灰度特征提取與統計分析，再將成像過后的試驗樣本使用蘇木精-伊紅染色法來進行試驗結果驗證。研究的主要目標是利用大量的數據進行統計分析，找到正常肝組織與癌變肝組織FFOCT圖像的特征參數的數值閾值以及兩者的特征參數的數值差異，證明肝組織FFOCT圖像的灰度特征可以作為評判一個肝組織樣本是否發生癌變的評判標準。

3 討論

對于肝癌的診斷，目前臨床上大多先采用CT、MRI等手段對肝組織進行成像，再由病理學家對所得的圖像進行甄別，判定是否有象征癌癥的結節或腫瘤等。為了進行確診，往往還需要進行病理檢查。但癌癥的發展是有一定的過程的，能夠在癌變的早期對生物組織的狀態進行判斷，從而實現對癌癥做到早發現、早治療是非常必要的。在癌變的早期，肝組織的細胞等發生的一系列變化可能比較微小，大范圍的CT、MRI檢查等可能會造成漏診。

為了觀察肝組織細胞的早期癌變特征，我們可以利用FFOCT系統的微米分辨率成像特性對肝組織進行成像，并提取FFOCT圖像的灰度特征，得到樣本FFOCT圖像灰度特征的特征參數的值，期望根據這些特征參數的值判斷樣本是否具有早期癌變特征。實際上，已有的研究表明，利用FFOCT系統可以得到許多生物組織樣本微米級別的光學斷層圖像。本課題組曾利用FFOCT系統得到清晰的洋蔥表皮細胞圖像［9］、豬肝細胞圖像［10］、人體離體的結腸、腎臟、肝等組織的圖像，并對所得到的圖像進行初步的辨識和分析［20-22］。法國Langevin研究所利用FFOCT系統對人體視網膜、角膜等進行成像，結果能夠得到較為清晰的眼部結構，這為眼科方面的臨床診斷提供了很大的研究價值［15-17］。同時，Langevin研究所用FFOCT系統對手指進行成像，得到了手指的內部指紋以及汗孔的圖像，這避免了傳統傳感器因手指有疤痕或褶皺、太濕或太干等原因而導致的指紋識別不成功的情況［18］。在疾病診斷方面，目前多是將生物組織樣本進行成像，得到樣本的FFOCT圖像后利用生物學知識對樣本進行人眼觀察，尋找與正常組織不同的病變組織，再利用病理學手段對樣本進行染色，以檢驗判斷是否正確。目前已將FFOCT應用于人體離體的正常卵巢組織與癌變卵巢組織［13］、正常乳腺組織與癌變乳腺組織［19］等，對這些組織所成的FFOCT圖像進行觀察，并使用一定的統計學手段進行分析，從而鑒別出組織是否癌變。

在本研究中，我們先對人體離體的肝組織進行成像，對所成的FFOCT圖像進行人眼觀察以及形態學分析，以揭示正常肝組織與癌變肝組織FFOCT圖像的灰度特征。研究證明，正常肝組織與癌變肝組織FFOCT圖像的灰度特征，包括均值、偏度、峰度與方差均具有不同的特征，從而可以以這些參數值的變化特征作為判斷肝組織樣本是否發生癌變的診斷參考。

此外，目前利用FFOCT系統進行的研究主要是對離體的人體組織和器官進行成像，活體成像僅限于對手指、眼睛等，且樣本數量有限，并未進行大量的試驗驗證。為了進一步確定FFOCT系統在癌癥診斷方面的價值以及定量分析的重要性，接下來應該進行大量的樣本試驗，并對不同的組織分別進行研究，再將不同的組織進行比較，研究其共性和差異。