堿脅迫對唐古特白刺生長及葉片超微結構的影響

張慧芳，閆海冰，馮 帆，于兆友，楊秀清

(山西農業大學林學院，030801，山西太谷)

土壤鹽堿化已成為一個全球性的資源和環境問題，這一生態災難嚴重制約農作物生長和林草等植被生存，打破了生態平衡及其系統穩定[1]。鹽堿化土壤對植物造成的脅迫既含有以NaCl和Na2SO4等中性鹽為主的鹽脅迫，也包括以NaHCO3和Na2CO3等堿性鹽為主的堿脅迫[2]。堿脅迫對植物形成除與鹽脅迫共有的離子毒害和滲透脅迫外，還有高pH值脅迫[3]。堿脅迫造成的pH值增高嚴重影響植物根部結構和細胞膜透性，導致根系活力降低，甚至影響植物葉片的結構和生理功能[3]，從而產生比鹽脅迫更強的生態破壞力。

唐古特白刺(Nitrariatangutorum)，一種生態抗逆兼果肉經濟型灌木，具有抗風沙、耐鹽堿、耐貧瘠等生態適應性，廣泛分布于寧夏、內蒙古、新疆等地區，在保持水土、改良鹽堿地及防風固沙等方面發揮著積極作用[4]。目前關于唐古特白刺的耐鹽性研究多集中在鹽脅迫，而對堿脅迫涉及相對較少。筆者擬采用不同濃度的NaHCO3和Na2CO3混合溶液對唐古特白刺進行堿脅迫處理，研究不同濃度堿脅迫下唐古特白刺的生長、生理響應及葉片超微結構的變化，探討唐古特白刺的耐堿能力及耐堿機制，以期為實現唐古特白刺在抑制鹽堿地土壤退化和實現鹽堿化土壤的持續生物改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子采集及幼苗培養

試驗所用唐古特白刺種子取自內蒙古巴彥淖爾市磴口縣的白刺產地(海拔1 036 m，E 106°28′，N 40°32′)。挑選大小一致、顆粒飽滿的種子于0.05% KMnO4溶液避光浸泡12 h，蒸餾水沖洗干凈備用。

采用純沙進行幼苗培養。將0.5% KMnO4溶液殺菌后的純沙置于16 cm×14 cm營養缽中，每缽播白刺種子20粒，共20缽，種植深度約4 cm，置于溫室內培養。培養條件為平均溫度26 ℃，光照時間14 h，光照強度1 200 Lux，每3天澆灌蒸餾水100 mL，沙子濕度約為飽和含水量的60%。

1.2 堿脅迫處理

堿溶液配置：NaHCO3和Na2CO3按摩爾比1∶1混合溶解于蒸餾水，設置4個濃度梯度：200、300、400、500 mmol/L。待實生苗長出6～8片真葉時，挑選長勢健壯、均勻一致的幼苗15缽，每缽6株，每個濃度處理幼苗3缽，每隔3 d澆灌不同濃度的堿溶液100 mL，對照組為蒸餾水100 mL，澆灌后及時將托盤中滲出的溶液倒回營養缽內，以防鹽分流失。處理45 d后進行生長及生理指標的測定。

從剩余5缽中取上述同樣標準的實生苗，每缽3株，將其根部直接浸于預先裝有不同濃度堿液的三角瓶中進行脅迫處理，對照組浸于蒸餾水中。待處理12 h后有幼苗葉片開始發黃或者萎蔫時，取幼苗中上部第2節完好葉片，切成適當小段備用于超微結構觀察。

1.3 指標測定及超微結構觀察

1.3.1 植株生長及生理指標測定 分別于堿脅迫試驗前和結束后測量幼苗株高；試驗結束后，每個處理隨機選取幼苗3株，蒸餾水沖洗干凈，置105 ℃烘箱殺青15 min，90 ℃烘干至恒質量，計算單株生物量。

根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑法；電解質滲透率測定采用電導儀法；葉綠素含量測定采用乙醇-丙酮混合液法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法；SOD活性測定采用氮藍四唑法；CAT活性測定采用紫外吸收法；脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法[5]。

1.3.2 透射電鏡樣品的制備與觀察 取各處理葉片相同部位(避開葉脈)切成1 mm×3 mm的矩形小塊，樣品在3%的戊二醛溶液中4 ℃固定24 h以上，0.1 mol/L(pH=7.0)磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸固定2 h后，重復使用0.1 mol/L(pH=7.0)磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min。再以30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇逐級脫水1次，每級15 min，100%乙醇脫水2次，每次20 min[6]。之后進行EPON812環氧樹脂浸透、包埋、聚合，萊卡EMUC6超薄切片機切片(切片厚度為70～90 nm)，收集到鎳網上，經醋酸鈾30 min、檸檬酸鉛10 min雙重染色，最后利用日立H-600透射電鏡進行觀察，拍片[6]。

1.4 數據分析

所有數據均采用方差分析和Duncan′s多重檢驗，在P<0.05時用R 3.3.1對每個參數進行檢驗。參數值以標準誤差(n=3)表示。

2 結果與分析

2.1 堿脅迫對唐古特白刺生長及生理指標的影響

由圖1可知，唐古特白刺株高、生物量、根系活力及葉綠素含量隨堿脅迫濃度的增大而下降，且均顯著低于對照組。其中，>300 mmol/L的堿脅迫濃度對生物量抑制作用極為顯著，生物量降幅達61.8%～81.8%。根系活力對堿脅迫較敏感，200 mmol/L時即顯著下降，降幅為58.3%，500 mmol/L時降幅可達83.3%。葉綠素含量隨堿脅迫濃度的增大存在22.0%～54.5%的降幅，但300 mmol/L和400 mmol/L堿脅迫處理間無顯著差異。

與對照相比，堿脅迫能引起唐古特白刺葉片丙二醛含量和電解質滲透率的增加，且不同濃度處理間存在顯著差異(圖1)。隨堿脅迫濃度的增大，丙二醛含量存在21.4%～114%的增幅，而電解質滲透率在堿脅迫200 mmol/L時即存在55.6%的增幅，500 mmol/L時增幅可達100%。

由圖2可知，唐古特白刺葉片SOD、CAT活性和脯氨酸含量呈堿脅迫低濃度上升、高濃度下降趨勢。與對照相比，除500 mmol/L堿脅迫外，其余脅迫濃度均可誘導這3個指標的顯著增加，且不同脅迫濃度間差異顯著。其中，CAT活性在堿脅迫200 mmol/L時增幅即為220%，300 mmol/L時活性達到最大，增幅為560%；而葉片SOD活性和脯氨酸含量在堿脅迫400 mmol/L時才達到最大，二者的增幅分別為250%和100%。

2.2 堿脅迫對唐古特白刺葉片超微結構的影響

2.2.1 葉肉細胞細胞壁與細胞質膜的變化 對照組中唐古特白刺葉肉細胞細胞壁光滑且透亮，細胞質膜無褶皺或突起(圖3)。堿脅迫200 mmol/L時細胞質膜內陷或向內折疊不明顯，很少有質膜突起；堿脅迫300 mmol/L時細胞壁有黑色顆粒出現；堿脅迫400 mmol/L時細胞質膜突起呈大小、形狀不一的小泡，細胞壁不再光滑，有溶解跡象；堿脅迫500 mmol/L時細胞質膜褶皺或突起明顯，細胞壁層次變得模糊(圖3)。

2.2.2 葉肉細胞葉綠體形態及其分布的變化 對照組中唐古特白刺葉肉細胞葉綠體為香蕉形，短軸約為長軸的1/4，分布在與空氣接觸的細胞壁一邊(圖4)。隨堿脅迫濃度的增加，葉綠體開始膨脹、變形并脫離質膜。與對照相比，葉綠體在堿脅迫300 mmol/L時開始腫脹變形為腎形，400 mmol/L時變為龜背形，500 mmol/L時變為花生形，短軸和長軸比例失衡，整個葉綠體離開質膜，且在400 mmol/L脅迫時個別葉綠體甚至游離向細胞中央的位置靠攏(圖4)。

圖1 堿脅迫對唐古特白刺株高、生物量、根系活力、葉綠素質量分數、丙二醛含量以及電解質滲透率的影響Fig.1 Effects of alkali stress on plant height, biomass, root activity, chlorophyll content, MDA (malondialdehyde) content and electrolyte permeability of Nitraria tangutorum

圖2 堿脅迫對唐古特白刺SOD、CAT活性和脯氨酸質量分數的影響Fig.2 Effects of alkali stress on SOD (superoxide dismutase), CAT (catalase) activity and proline content of Nitraria tangutorum

CW: 細胞壁 Cell wall. CM: 細胞膜 Cell membrane.圖3 不同濃度堿脅迫下唐古特白刺葉肉細胞壁和細胞膜的變化Fig.3 Mesophyll cell wall and cell membrane changes of Nitraria tangutorum under different alkali stress

GL: 基粒片層 Grana lamella. Ch: 葉綠體 Chloroplas. SL: 基質片層 Stroma lamellae. SG: 淀粉粒 Starch granules. P: 質粒 Plastoglobules. 圖4 不同濃度堿脅迫下唐古特白刺葉綠體形態和分布的變化Fig.4 Mesophyll chloroplast morphology and distribution of Nitraria tangutorum under different alkali stress

2.2.3 葉肉細胞葉綠體類囊體結構的變化 對照組中唐古特白刺葉肉細胞葉綠體外膜完整平滑，無折疊現象，膜間隙與基質被內膜明顯隔離開，基質呈均質狀，類囊體沿葉綠體長軸平行有序排列，基粒片層結構緊致清晰(圖4)?；ｎ惸殷w在堿脅迫300 mmol/L時排列散亂，400 mmol/L時出現囊泡化，500 mmol/L時有溶解，片層結構消失跡象(圖4)。

2.2.4 葉肉細胞葉綠體淀粉粒和嗜鋨顆粒的變化 300 mmol/L堿脅迫時唐古特白刺葉肉細胞葉綠體中間膨大部位出現淀粉粒，淀粉粒長度約為葉綠體長度的1/5，沿葉綠體長軸分布(圖4)。其他濃度堿脅迫下葉綠體中未見淀粉粒的出現。堿脅迫處理下，葉綠體中均出現嗜鋨顆粒，且其數量、體積較對照都有不同程度增加。堿脅迫400 mmol/L和500 mmol/L時有大量嗜鋨顆粒集聚成堆出現(圖4)。

3 討論

3.1 堿脅迫下唐古特白刺的生長及生理響應

生長抑制是植物在鹽堿脅迫下的綜合表現[7]，本研究中堿脅迫后唐古特白刺株高、生物量的降低即是最好的例證。逆境除抑制植物生長外，還會引起一系列的生理代謝紊亂，而植物通過相應的生理變化來適應或抵制逆境脅迫[8]。非生物脅迫中，根系是首先并直接遭受傷害的部位[9]。低濃度堿脅迫時唐古特白刺根系活力即顯著下降，可能由于堿脅迫造成其根系周圍的高pH值引起金屬離子和磷的積累，損害根部組織結構，導致根系吸收功能減弱，根系活力降低[10]。葉綠素是光合作用的主要色素[11]，隨堿脅迫濃度的增大，其含量減少，可能由于堿脅迫使葉綠素酶活性降低，葉綠素分解加速，或者堿脅迫使其葉綠體蛋白和葉綠素結合受到影響，導致更多的葉綠素受損[12]。另有研究表明，堿脅迫處理可能打破了鎂離子在植物體內的正常狀態，從而導致葉綠素形成受阻[11]。同時，唐古特白刺葉片MDA含量及電解質滲透率隨堿脅迫濃度的增大而持續上升，這與張磊等[10]的研究結果相似，即堿脅迫濃度的增大會加劇膜脂過氧化程度，破壞質膜的選擇透過性，導致電解質大量外滲，加劇對細胞膜的傷害程度。

本研究中，唐古特白刺葉片SOD和CAT活性在低濃度堿脅迫時上升，高濃度堿脅迫時下降。由此可知，一定濃度的堿脅迫可以誘導SOD和CAT活性的增加。SOD和CAT作為生物防御體系的關鍵酶，可有效保護細胞免受活性氧傷害[13]。低濃度堿脅迫時，唐古特白刺可能通過增強SOD和CAT酶活性以消除和轉化超氧陰離子及過氧化氫，維持細胞正常的代謝活動。但高濃度堿脅迫時，細胞代謝紊亂加劇，產生過多超氧陰離子及過氧化氫，使SOD和CAT大量消耗，同時，膜脂過氧化加劇，膜系統損傷加重，影響SOD和CAT的分泌和激活過程，從而導致SOD和CAT活性的下降[13]。另試驗發現，300 mmol/L堿脅迫時唐古特白刺葉片CAT活性顯著升高，其原因可能是CAT對過氧化氫親和力較低，只有當SOD分解超氧陰離子產生的過氧化氫得到積累時CAT活性才能被大幅度激活。

脯氨酸(proline)是植物在逆境脅迫下累積的主要有機分子[14]。曲元剛等[9]研究發現，Na2CO3引起的Pro增加幅度遠大于NaCl，認為Pro是植物體內調節pH的一種緩沖物質。本研究中，Pro含量在堿脅迫濃度≤400 mmol/L時得以積累可能由于較低濃度的堿脅迫促使Pro合成酶的活化，抑制Pro的生物降解造成的[8]。也有研究表明，逆境脅迫導致線粒體膜對Pro選擇透性下降也是造成胞質內Pro積累的重要原因[15]。500 mmol/L堿脅迫時Pro含量減少可能由于高濃度堿脅迫下細胞代謝紊亂，葉綠體、線粒體結構受損嚴重，酶活性降低，而催化Pro合成的酶位于胞質或葉綠體中,氧化降解酶位于線粒體中[15]，導致Pro合成受阻，含量減少。

3.2 堿脅迫下唐古特白刺超微結構的變化

膜結構和細胞器的破壞，是植物受到鹽害的普遍特征，其破壞程度與植物的耐鹽堿性息息相關[16]。唐古特白刺經堿脅迫后，細胞壁不再光滑，出現沉淀或溶解趨勢；細胞質膜則出現褶皺或突起產生形狀、大小不一的小泡，其中以高濃度脅迫時變化最為顯著。這些變化不僅說明堿脅迫對唐古特白刺細胞壁及質膜造成一定損傷，也說明其利用自身結構的改變來積極適應不良環境，既可以消除過多破損的膜，加快更新，也可以把過多的鹽分收集在液泡中，提高液泡濃度，增加細胞的滲透勢[17]。

葉綠體是眾多細胞器中對鹽堿脅迫最為敏感的[18]。近年來研究者們通過對逆境脅迫下桂花(Osmanthusfragrans)[16]、核桃(Juglansregia)[19]、棉花(Gossypiumhirsutum)[20]、刺槐(Robiniapseudoacacia)[21]等葉綠體超微結構的研究，發現由于不同植物對逆境的適應能力不同，導致葉綠體形態變化存在差異，同時，逆境脅迫可導致葉綠體類囊體排列松散變形，基粒片層垛疊數量減少或模糊不清，破壞葉綠體被膜甚至失去完整膜結構等[16]。筆者發現，堿脅迫處理下的唐古特白刺葉綠體由香蕉形變為腎形、龜背形和花生形不等，這首先從外部輪廓上印證了不同濃度堿脅迫對葉綠體損傷程度的大小不一。其次，各堿脅迫濃度下葉綠體均不同程度的剝離細胞壁，而植物葉綠體通常緊貼細胞壁分布于與空氣接觸的質膜旁，這樣的分布有利于葉綠體與外界進行氣體交換，當葉綠體離開質膜時，葉綠體內正常光合運轉功能可能受阻。葉綠體剝離細胞壁可能是由于隨堿脅迫濃度的增加，葉綠體膜受損發生滲漏，體積縮小造成的。

300 mmol/L堿脅迫時唐古特白刺葉綠體中淀粉粒的出現，可能由于線粒體膜受到損傷，出現能量供應障礙，導致光合產物以淀粉粒的形式沉積，也可能是由于葉綠體結構受損，高濃度鹽堿阻礙淀粉的水解和向外運輸造成的[7]。葉綠體內淀粉粒補償性增多，體積變大，可彌補逆境脅迫造成的能量供應不足，提高細胞質濃度，保證水和無機營養的供給[13]。未脅迫時，唐古特白刺葉綠體中嗜鋨顆粒數量相對較少，體積相對較小，而高濃度堿脅迫時數量增多，體積變大，且集聚成堆出現。嗜鋨顆粒的存在可以提供脂質供膜的更新，以保持膜結構的完整性，同時，逆境脅迫時嗜鋨顆粒會降解為糖，提高細胞中糖的濃度，進而增加植物的抗性[17]。因此，淀粉粒的出現和嗜鋨顆粒的增多變大對唐古特白刺完成在極端環境下的生活史意義重大[6]，也進一步驗證了唐古特白刺具有一定的耐鹽堿性。

4 結論

低濃度堿脅迫對唐古特白刺生長具有一定抑制作用，≥300 mmol/L的堿脅迫濃度對白刺生長及葉片超微結構產生明顯的抑制及損傷。堿脅迫下SOD、CAT活性和Pro質量分數的提高，嗜鋨小體增多變大以及淀粉粒的出現，表現唐古特白刺對堿脅迫有較強的適應能力。