空間轉錄組概述和研究進展

廖成敏

（昆明理工大學，云南 昆明 650500）

人體組織是高度復雜的系統，由萬億個細胞組成，這些細胞在種類、時間和空間上有所不同，但它們相互協調，形成獨特的微環境，以維持器官功能和處理信息，進而確定細胞類型。基于對人體器官分子基礎的研究發現，哺乳動物器官轉錄異質性是由類型、狀態、數量不同的細胞因發育（時間）和區域（空間）存在差異而造成的。

高通量單細胞轉錄組測序技術（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）通常用于鑒定細胞類型和推斷發育軌跡等。scRNA-seq方法應用廣泛，包括偽時態分析[1]、條形碼標記細胞的起源[2]、以特定時間間隔連續采樣[3]，可以揭示細胞命運、決定細胞譜系和發育軌跡。然而，scRNA-seq無法解決空間異質性的問題，基于微流控scRNA-seq技術，例如inDrop、Dropseq、microwell-seq和Split-seq等在組織消化后，細胞形成懸浮液，此時已丟失空間位置信息，無法將單細胞轉錄組信息與空間位置進行匹配。

因此，獲取空間轉錄組信息是研究人員的長期目標，從早期嘗試使用熒光原位雜交（Flourescence In Situ Hybridization，FISH）的方法[4]，到目前單細胞分辨率下的空間轉錄組檢測[5]。最近，某學者使用了早先提出的一種RNA成像方法和FISH技術描繪了下丘腦視前區的空間分辨圖譜[6]，發現下丘腦視前區覆蓋了大約70個神經元簇，遠遠少于整個大腦。此外，同一群體內的細胞具有不同的分子特征，為了更好地了解細胞異質性，有必要同時記錄它們的轉錄異質性和空間坐標。

1 空間轉錄組的主要優勢

首先，空間轉錄組可以提供基因表達的“組織空間位置”信息，彌補單細胞轉錄組的最大缺點。其次，空間轉錄組實驗只需要提供“組織切片”，但是單細胞轉錄組需要制備細胞懸浮液或“原生質體”，而在植物中，原生質體的獲得非常困難。最后，空間轉錄組得到的空間位置信息可以作為細胞類群判定的一種注釋信息，結合組織解剖學等知識，可以更快、更好地判斷細胞所屬類群，這在非模式物種的單細胞組學研究中具有很好的應用前景。

2 空間分辨轉錄學技術的研究進展

一般而言，現有的產生空間分辨轉錄本的方法可分為4類：

（1）利用計算機算法，根據單細胞轉錄組數據模擬重構組織的空間形態。例如Seurat是一個在單細胞數據分析中廣泛用到的R包，可以利用scRNA-seq數據，加上對標志基因進行原位測序的結果重構組織的空間信息。

（2）激光顯微切割加二代測序（LCM+NGS）。這種技術對儀器和實驗人員的操作要求較高，而且獲取的通量也比較低，如果組織非常珍貴或者研究的內容十分精細，可以考慮使用這種方法。但是這種方法因細胞通量低，應用較為困難。

（3）基于高分辨圖像的原位測序。最經典的是smFISH，但這種方法的通量比較低。最近發布的FISH-seq技術通過多輪雜交的方式，已經把測序通量提高到了超過 10 000個轉錄本。

（4）基于空間條形碼（spatial barcodes）的空間轉錄組技術，是目前的主流技術。以商業化的10x Genomics Ⅴisium為例，簡述基于空間條形碼的空間轉錄組工作流程。整個流程一共分為6步：第一，將冷凍組織切片，把切片放到芯片上。第二，用HE或者IF對組織切片進行染色，類似于“質控”，用來檢驗切片和貼片是否成功。第三，組織透化。在這一步中，向切片添加透化試劑，使得細胞的mRNA垂直向下釋放到spot中，并與連有空間條形碼的捕獲極進行連接，然后通過被捕獲的mRNA反轉錄形成cDNA。第四，去除組織切片，釋放cDNA，進入測序文庫構建。第五，測序，目前通常使用illumina二代測序。第六，數據分析，目前已經開發了很多成熟的分析包。

3 展望

雖然空間轉錄學在發現疾病因子、建立空間圖譜和描繪空間藍圖方面得到了廣泛的應用，但其潛力遠不止于此。例如，在細胞間通信的研究中，從轉錄組數據和已知的配體-受體復合物中推斷出不同細胞類型的上下信號串擾[7]。然而，單個細胞間正在進行的相互作用很難立即捕捉。無論是在組織中還是在培養環境中，緊密空間中的細胞更有可能相互作用，這正是空間轉錄技術的作用。空間轉錄組被引入細胞間通信的研究是有希望的。一些實驗已經顯示了缺血神經元的體細胞和軸突線粒體在單細胞尺度上的通信[8]。利用圖像的方法（如seqFISH+、Merfish和Starmap）可以為觀察單個細胞內的分子行為提供亞細胞視圖，使分析基因-基因相互作用、基因調控網絡和多模式組學成為可能[9]。研究表明，DNA變異與mRNA表達有關[10]，因此，同時檢測處于原始坐標的分子可以加深人們對轉錄因子如何激活基因進行表達、基因如何相互溝通以及細胞如何運作的理解。突破這些瓶頸已成為下一個發展方向。

在這些障礙中，當前技術的主要挑戰是從單細胞原位獲得無偏向性的轉錄組，因為現有大多數基于實驗的方法都是從靶向方法smFISH衍生出來的。SMR、SmHCR和osmFISH具有較高的檢測效率和信號強度。相比之下，seqFISH+和Merfish可以從大量細胞中原位測量超過 10 000個mRNA，但它們不能準確檢測新序列或小序列變體。FISH-seq是一種介于靶向性和無偏向性方法之間的折中解決方案，但這種方法效率低，難以在組織上實施，僅對較短的讀數進行測序，無法準確檢測變異體或新片段。基于LCM的方法，一旦突破了細胞通量低的瓶頸，就具有巨大的潛力，因為它們可以通過深度測序獲得全基因覆蓋的轉錄本。在計算機技術中，這些方法充分利用了來自scRNA-seq、原位雜交和已發表的現有數據來重建組織的空間轉錄。然而，細胞的實際坐標不能完全匹配，這些方法通常會簡化建模過程以便于計算。因此，需要開發能夠伴隨高通量scRNA-seq的高空間分辨率的新技術。這些較為完善的技術的出現，將使它們在解決一系列生物學問題方面得到廣泛的應用。